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DNA实验

腺相关病毒(AAV)在动物实验中的应用

2024-09-21 DNA实验 加入收藏
腺相关病毒属于微小病毒科(parvovirus),为无包膜的单链线状DNA病毒,基因组大小约4.7kb。利用腺相关病毒可以将外源基因转入动物组织和细胞中,具有安

腺相关病毒属于微小病毒科(parvovirus),为无包膜的单链线状DNA病毒,基因组大小约4.7kb。利用腺相关病毒可以将外源基因转入动物组织和细胞中,具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广、表达稳定等多种优点,广泛应用于动物体内研究。

腺相关病毒血清型众多(12种),不同血清型对不同组织亲和性不同,因此在具体科学研究中,以下问题往往困扰着广大科研工作者:选择何种血清型?如何注射?注射多少病毒?注射部位如何选择?注射多久检测?本文就常见的注射部位(大脑、视网膜、肝脏、心脏和动脉、肺脏、肾脏、肌肉、肠)和方法做一个简单的归纳,希望能够为大家提供一个概念和思路。一、大脑大脑组织常用血清型有 AAV1,AAV2,AAV5,AAV8 和 AAV9,其中神经组织常见的血清型有 AAV2,AAV5 和 AAV8.对大脑组织而言,AAV5 应用范围更广,AAV8 更有效(值得注意的是,在猴子的神经组织中,AAV5 更有效)。从作用效果上看,AAV8 大于 AAV1.针对大脑组织不同部位,AAV 不同血清型靶向性有所差异:1)海马组织:AAV9 比 AAV8 更有效;2)神经组织不同的细胞,不同血清型靶向性不同:如神经元常用的血清型有 AAV1、AAV2、AAV5 和 AAV9;星形胶质细胞和少突胶质细胞常用的血清型有 AAV1 和 AAV5.总体而言,在所有组织中,AAV2 适用性最广并在脑部组织也有所体现,例如其可以达到大脑组织75% 的区域。AAV2、AAV5、AAV8 和 AAV9也比较常见,应根据不同组织进一步慎重选择,在此介绍几种特例:1、肠神经系统(Enteric Nervous System ENS),是由神经细胞组成的复杂网络,遍布整个肠胃消化管道。其神经元的数量和脊髓相当(约1亿个神经细胞)。该神经系统在人体躯干下部,属于迷走神经,以薄层的形式分布于消化肌之间,调节消化。常用 AAV5、AAV6、AAV8 和 AAV9.AAV6 对肠神经胶质和神经元有一定的靶向性。注射部位可以选择降结肠,注射量和滴度: 滴度为 1.3 × 1012 GC/ml的病毒注射 5 μl 即可,检测时间:注射后 2 周开始表达,2-6周均有检测。

2、脑组织常见的血清型为 AAV9,注射方法:左心室注射或者侧脑室注射,注射剂量和滴度:选择滴度为 0.5–4.0 × 1011 GC/ml 的病毒液,稀释成 100 μl ,注射两周之后(14d)开始检测。

二、视网膜视网膜组织常用血清型有 AAV1、AAV2 和 AAV5.视网膜组织由于其特殊性,因而有自身的特点:注射成功率 20-30%,容易造成视网膜炎症和损伤,注射完需要使用 1% 阿托品(和少量新霉素、多粘菌素B硫酸盐和地塞米松眼膏施用于眼睛,延长瞳孔扩张时间,减少腺体分泌,减少炎症反应),连续使用 3-5 d.其常用的注射量为 0.5 μl ,病毒滴度 1.5x107 GC/ml.常用注射方法:视网膜下注射或者玻璃体注射。但不同血清型又有不同特点:AAV1 主要作用于视网膜上皮细胞,注射后 2-4 周可以检测;AAV2 主要作用于感光细胞、视网膜上皮细胞和玻璃体,AAV2 玻璃体注射后分布广泛,2-4 周可以检测; AAV5 可作用于视网膜上皮细胞和感光细胞,在感光细胞中表达 AA5>AAV2,2-4 周检测。下图为一些视网膜组织的注射情况

三、肝脏

对肝脏而言,主要的腺相关病毒载体有:AAV2、AAV5、AAV7 和 AAV8,其中 AAV7 和 AAV8 的效率是 AAV2 的 10-100 倍。注射部位常选择门静脉、外周静脉和尾静脉。注射病毒滴度一般选择 8×1010-2×1012(GC/kg)(人、灵长类);1×1011 GC/只鼠,稀释成 50-100 μl 进行尾静脉注射;注射后 2 周之后可以检测。

四、心脏和动脉对心脏和动脉而言,常用载体有:AAV1、AAV6、AAV8 和 AAV9.其中 AAV2、AAV5、AAV7 也可以使用,但是表达比较慢,3 个月后表达量才能与 AAV1、AAV6 表达量相当。

所有血清型中 AAV8 和 AAV9 最有效,2 个月左右其表达量达到最高。常见的注射部位为冠状动脉、主动脉、心肌和尾静脉。注射病毒滴度为 1.9×1011-1012 GC/ml,稀释成 100μl-250μl(大鼠剂量稍高于小鼠)注射;但是对于心脏原点注射而言,常采用 1010 GC/ml 病毒滴度,稀释成 20 μl 使用。检测时间:一般在 2 周之后可以检测。

五、肺脏肺脏常用的腺相关病毒载体有 AAV1、AAV2、AAV5、AAV6 和 AAV9.由于肺脏表面唾液酸受体分布比较多,因此 AAV5 型比较常用;相比之下 AAV2 和 AAV6 转导效率相当。常见的注射方式有滴鼻、雾化吸入或气管内注射,注射病毒滴度为 1012 GC/ml ,稀释成 3 μl,注射完之后 2 周可以检测表达情况

六、肾脏

肾脏常用载体有 AAV2、AAV8 和 AAV9.注射病毒的滴度一般选择 1-5×1011 GC/ml,稀释成 50-200 μl 注射。常见的注射部位有肾动脉、肾静脉和左髂脉、腹主动脉,注射完 2 周之后可以检测表达情况。下图为注射的一些情况:

七、肌肉肌肉组织常用血清型有 AAV2、AAV8 和 AAV9.其中 AAV8、AAV9 最常用,心肌、胰腺和肾上腺也是如此。骨骼肌分为快速和慢速肌纤维,AAV2 常作用于慢速肌纤维;AAV6 则对二者都有效。对不同年龄阶段的鼠,注射剂量有所不同:幼鼠选择的病毒量为 7×1010 -1.2×1011 GC/g;成年鼠选择的病毒量为 3.5 ×1011 -7×1012 GC/只;但是低剂量的 AAV9 不能到达所有心肌细胞。下图为注射的一些情况:

八、肠肠组织常用血清型有AAV1、AAV2 和 AAV5.常见的注射方式有口服、灌肠、腹腔注射、肠系膜动脉注射。一般选择注射滴度1×1011 GC/ml, 稀释成 100 μl(PBS 或者稀释液稀释)使用,注射 2 周后可以检测。参考文献:1.Weinberg, M.S., R.J. Samulski, and T.J. McCown, Adeno-associated virus (AAV) gene therapy for neurological disease. Neuropharmacology, 2013. 69: p. 82-8.2.Iwata, N., et al., Global brain delivery of neprilysin gene by intravascular administration of AAV vector in mice. Sci Rep, 2013. 3: p. 1472.3.Pang, J.J., et al., Comparative analysis of in vivo and in vitro AAV vector transduction in the neonatal mouse retina: effects of serotype and site of administration. Vision Res, 2008. 48(3): p. 377-85.4.Lisowski, L., et al., Selection and evaluation of clinically relevant AAV variants in a xenograft liver model. Nature, 2014. 506(7488): p. 382-6.5.Wang, L., et al., Sustained expression of therapeutic level of factor IX in hemophilia B dogs by AAV-mediated gene therapy in liver. Mol Ther, 2000. 1(2): p. 154-8.6.Nathwani, A.C., et al., Safe and efficient transduction of the liver after peripheral vein infusion of self-complementary AAV vector results in stable therapeutic expression of human FIX in nonhuman primates. Blood, 2007. 109(4): p. 1414-21.7.Manno, C.S., et al., Successful transduction of liver in hemophilia by AAV-Factor IX and limitations imposed by the host immune response. Nat Med, 2006. 12(3): p. 342-7.8.Palomeque, J., et al., Efficiency of eight different AAV serotypes in transducing rat myocardium in vivo. Gene therapy, 2007. 14(13): p. 989-997.9.Vassalli, G., et al., Adeno-associated virus (AAV) vectors achieve prolonged transgene expression in mouse myocardium and arteries in vivo: a comparative study with adenovirus vectors. International Journal of Cardiology, 2003. 90(2-3): p. 229-238.10.Bish, L.T., et al., Adeno-associated virus (AAV) serotype 9 provides global cardiac gene transfer superior to AAV1, AAV6, AAV7, and AAV8 in the mouse and rat. Human gene therapy, 2008. 19(12): p. 1359-1368.11.Halbert, C.L., et al., Repeat transduction in the mouse lung by using adeno-associated virus vectors with different serotypes. Journal of virology, 2000. 74(3): p. 1524-1532.12.Takeda, S., et al., Successful gene transfer using adeno-associated virus vectors into the kidney: comparison among adeno-associated virus serotype 1-5 vectors in vitro and in vivo. Nephron Exp Nephrol, 2004. 96(4): p. e119-26.13.Qi, Y.F., et al., Comparison of the transduction efficiency of tyrosine-mutant adeno-associated virus serotype vectors in kidney. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2013. 40(1): p. 53-5.14.The potent dial of adeno-assoc iated viral vectors for gene delivery to muscle tissue. Expert Opin Drug Deliv., 2014. 11(3)。15.Z Wang1, H.-I.M., 3, J Li1, L Sun1, J Zhang1 and X Xiao1,2, Rapid and highly efficient transduction by doublestranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Therapy, 2003. 2003(10): p. 2105—2111.16.Polyak, Steven, et al. “Gene delivery to intestinal epithelial cells in vitro and in vivo with recombinant adeno-associated virus types 1, 2 and 5.” Digestive diseases and sciences 53.5 (2008): 1261-1270.17.Polyak, S., et al., Gene delivery to intestinal epithelial cells in vitro and in vivo with recombinant adeno-associated virus types 1, 2 and 5. Digestive diseases and sciences, 2008. 53(5): p. 1261-1270.


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