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DNA实验

RFLP和RAPD技术原理和操作步骤

2024-09-23 DNA实验 加入收藏
原理:DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片

原理:

DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种(个体)基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变,或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失,导致酶切片段大小发生了变化,这种变化可以通过特定探针杂交进行检测,从而可比较不同品种(个体)的DNA水平的差异(即多态性),多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。

所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆,位于染色体的不同位点,从而可以作为一种分子标记(Mark),构建分子图谱。当某个性状(基因)与某个(些)分子标记协同分离时,表明这个性状(基因)与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小,即表示目标基因与分子标记之间的距离,从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上,可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA后,所切的片段类型不一样,因此,限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ,BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多,则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。

运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(Random amplified polymorphic DNA ,随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD技术诞生的时间很短, 但由于其独特的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。

RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外,RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。

本实验将学习RFLP的酶切,电泳和膜的制作以及RAPD技术。探针标记及杂交检测方法请另详见分子杂交技术。

RFLP技术

一、 材料

基因组DNA(大于50kb,分别来自不同的材料)。

二、设备

电泳仪及电泳槽, 照相用塑料盆5只,玻璃或塑料板(比胶块略大) 4块,吸水纸若干,尼龙膜(依胶大小而定),滤纸 ,eppendorf管(0.5ml)若干。

三、试剂:

1、限制性内切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。

2、5×TBE电泳缓冲液:配方见第一章。

3、变性液:0.5mol/L NaOH,1.5mol/L NaCl 。

4、中和液:1mol/LTris·Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。

5、10×SSC:配方见第九章。

6、其它试剂:0.4mol/L NaOH,0.2mol/L Tris·Cl, pH7.5/2×SSC ,ddH2O,Agarose 0.8%, 0.25mol/L HCl 。


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