制备和转化感受态大肠杆菌的Hanahan方法实验（高效的转化策略）
原理20 世纪 70 年代晚期和 80 年代早期，Dong Hanahan 在冷泉港实验室和哈佛大学做研究生的时候，他做出了以前从未听说过的转化效率，并且在以后
原理
20 世纪 70 年代晚期和 80 年代早期，Dong Hanahan 在冷泉港实验室和哈佛大学做研究生的时候，他做出了以前从未听说过的转化效率，并且在以后他的方法被标准化了。
材料与仪器
质粒 DNA 大肠杆菌
甲亚砜 DMSO DnD 溶液 转化缓冲液
SOB 琼脂板 SOC 培养基 Sorvall GSA 转头或与之相当的转头 液氮 聚丙烯离心管 水浴
甲亚砜 DMSO DnD 溶液 转化缓冲液
SOB 琼脂板 SOC 培养基 Sorvall GSA 转头或与之相当的转头 液氮 聚丙烯离心管 水浴
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
(1) 甲亚砜 DMSO
二甲亚砜的氧化产物据推测为二甲硫醚，是转化的抑制物。
(2) DnD 溶液（DMSO 和 DTT)
DTT（二硫苏糖醇）1.53 g，DMSO 9 ml，1 mol/L 乙酸钾（pH 7.5) 100 μl，H2O 补至 10 ml。
DnD 溶液用可耐受有机溶剂的 Millex SR 膜（Millipore) 过滤除菌，将 DnD 溶液分装成 160 μl 小份放入 0.5 ml 的无菌微量离心管中，密封管口，贮存于 -20℃。
(3) 转化缓冲液
标准的转化缓冲液（TFB）一般现用现配。冻存的缓冲液（FSB）用来冻存（-70℃）感受态细胞。
2. 培养基
(1) SOB 琼脂板含 20 mmoI/L MgSO4 和适量的抗菌素
标准的 SOB 琼脂板含 10 mmoI/L MgSO4。
(2) SOB 培养基含 20 mmol/L MgSO4
标准的 SOB 培养基含 10 mmol/L MgSO4。
(3) SOC 培养基
每次转化反应需 1 ml 的 SOC 培养基。
3. 核酸和寡核苷酸
质粒 DNA （重组质粒）
4. 离心机和转头
Sorvall GSA 转头或与之相当的转头
5. 专用设备
(1) 液氮
(2) 预冷的聚丙烯离心管（50 ml）
(3) 预冷的聚丙烯离心管（17X100 mm；Falcom 2059）
(4) 预置的 42℃ 水浴
6. 载体和菌种
冻存的做转化用的大肠杆菌
该菌种需在 -70℃ 下保存。
二、方法
1. 细胞的制备
(1) 转化缓冲液的准备
若制备立即使用的惑受态细胞可用 TFB。若制备贮存于 -70℃ 的感受态细胞则用 FSB。来自配制转化缓冲液的水的有机物污染会降低感受态细胞的转化率。因此，采用直接从质量很好的 Milli-Q 过滤系统（Millipore) 取得的水将会得到满意的结果。假如出现问题，使用前可用活性炭处理去离子水。
① 制备标准转化缓冲液
A. 1mol/L 的MES 缓冲液的配制：将 19.52 g MES 溶于 80 ml 纯水（Milli-Q 级，或与之相当级别的）中，用 5 mol/L 的 KOH 调 pH 至 6.3，最后用纯水定容至 100 ml，用预先处理的 Nalgene 滤膜（0.45 μm 孔径）过滤除菌。以 10 ml/份分装，于 -20℃ 保存。
B. TBF 溶液的配制：将下表列出的成分溶解于 500 ml 水中，然后加 10 ml 1 mol/L 的 MES 缓冲液（pH 6.3)。最后用纯水定容至 1 L。
C. TFB 溶液用预先处理的 NaIgene 滤器（0.45 μm 孔径）过滤除菌，按 40 ml/份分装成小份贮存于组织培养瓶（Corning，或与之相当的瓶）中，并置于 4℃ 保存。
② 制备冻存缓冲液
A. 将 9.82 g 乙酸钾溶于 90 ml 纯水（Milli-Q 级或与之相当级别的）中制成 1 mol/L 的乙酸钾，然后用 2 mol/L 乙酸调 pH 值至 7.5，加纯水至终体积为 100 ml，将溶液分成小份，贮存于 -20℃。
B. 配制 FSB 溶液：用 500 ml 纯水将下表列出的所有成分溶解，待试剂溶解后，用 0.1 mol/L 的 HCl 调 pH 值至 6.4。如调过头，不要用碱重调，而应弃去溶液重配。用纯水将体积补至 1 L。
C. 溶液用预先处理的 Nalgene 滤膜（0.45 μm 孔径）过滤除菌。分装成 40 ml 小份，装入组织培养瓶（Corning 或与之相当的瓶）中贮存于 4℃。贮存期间，溶液的 pH 值将会下降至 6.1~6.2。此后，pH 值将稳定不变。
(2) 用无菌接种环直接从冻存的大肠杆菌贮存液中所需的菌种在 SOB 琼脂板表面划线，于 37℃ 培养 16 h。
没有必要将冻存菌融化，接种环划过冻存菌表面所带的菌已经足够了。一管冻存菌可以用多次。
(3) 将 4~5 个分隔良好的菌落转移到 1 ml 含 20 mmol/L MgSO4 的 SOB 中。中速振荡使细菌分散，然后在 1 L 锥形瓶中用 30~ 100 ml 含 20 mmol/L MgSO4 的 SOB 稀释培养物。
(4) 于 37℃ 将细菌培养 2.5~3 h，监测培养物的生长情况。
为达到高效转化，活细胞数务必少于 108 细胞/ml，对于大多数大肠杆菌来说，这相当于 OD600 值为 0.4 左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可毎隔 15 - 20 min 测定 OD600 值来监测，用检测的时间及 OD600 值列一个图表，以便预测培养物的 OD600 值达到 0.4 的培养时间，当 OD600 值达到 0.35 时，收集细菌培养物。
由于未明原因，在大肠杆菌的生长曲线上，有两个时期的大肠杆菌可以有较高的转化效率，一个在初期（OD600 =0.4）( Hunahan 1983)，另一个在末期（OD600=0.95）( Tang et al, 1994)。前期收获的菌容易有效是因为它的高转化率能持续的时间更长，而后期的生长峰较陡峭，在收集细菌时若稍耽误 2~3 min，将会使转化效率降低一个数量级。
在菌株与菌株之间，OD600 值与每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的 OD600 值，并将各稀择浓度的培养物铺于无抗生素的 LB 琼脂板以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度计读数得到标准化。
(5) 将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的 50 ml 聚丙烯管中，在冰上放置 10 min，使培养物冷却至 0℃。
(6) 于 4℃ 以 2700 g（用 Sorvall 转头相当于 4100 r/min）离心 10 min，回收细胞。
(7) 倒出培养液，将管倒置 1 min 以使最后残留的痕量培养液流尽。
(8) 用约 20 ml ( 每个 50 ml 管）冰冷的转化缓冲液（TFB 或 FSB)，重悬沉淀，将重悬细胞液冰浴 10 min。
(9) 于 4℃ 以 2700 g ( 用 Sorvall 转头相当于 4100 r/min) 离心 10 min，回收细胞。
(10) 倒出培养液，将管倒置 1 min 以使最后残留的痕量培养液流尽。
(11) 用 4 ml ( 每个 50 ml 管）冰冷的转化缓冲液（TFB 或 FSB ) 轻轻振荡，重悬沉淀。按步骤 (12) 第一部分给出的操作程序制备立即使用的感受态细胞，而步骤 (12) 第二部分制备贮存于 -70℃ 留待后用的感受态细胞。
2. 感受态细胞的制备
(12) 制备转化用的感受态细胞
① 新鲜感受态细胞的制备
A. 将 140 μl DnD 溶液加到每一细胞悬液的中心，立即轻轻旋转以混匀悬液，然后在冰上放置 15 min。
B. 每管再加 140 μl DnD 溶液，轻轻旋转以混匀悬液，再在冰上放置 15 min。
C. 将小份悬液分装到冷却的无菌聚丙稀管（17X100 mm) 中，将管置于冰上。
② 冻存感受态细胞的制备
A. 每 4 ml 重悬细胞液加 140 μl DMSO，轻轻旋转混匀之，将悬液置冰上 15 min。
B. 每份细胞悬液再加 140 μl DMSO，轻轻旋转混匀之，置冰上 15 min。
C. 迅速将悬液分装到冷却的无菌微量离心管或组织培养管中，封紧管口，没入液氮中快速冰冻感受态细胞。贮存于 -70℃ 备用。
D. 需要时，从 -70℃ 冰箱中取出一管感受态细胞，把管握于手心，融化细胞。细胞一经融化，立即把管转移至冰浴中，在冰上放置 10 min。
E. 用一冷的无菌吸头把感受态细胞转移到冷却的无菌聚丙烯管（17 X 170 mm) 中， 放置在冰浴上。
3. 转化
包括阳性和阴性对照。
(13). 将要转化的 DNA 片段加入到装有感受态细胞的管中（50 /4 感受态细胞需 25ngDNA)，体积不应超过感受态细胞的5%，轻轻旋转几次混匀内容物。实验中至少 设两个对照管：一个含有感受态细胞和已知量的超螺旋质粒DNA，另一管只有感 受态细胞。混匀内容物，冰浴 30 min。
(14) 将管放入预加温至 42℃ 的循环水中，恰恰放置 90 s，不要摇动管。
热激是一个关键步骤，准确地达到热激温度非常重要。这里的温度及温育的时间都是使用 Falcon 2059 管 的测量参数，其他类型的管将可能获得不同的结果。
(15) 快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却 1~2 min。
(16) 每管加 800 μl SOC 培养基，用水浴将培养基加温至 37℃，然后将管转移到设置为 37℃ 的摇床上，温育 45 min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
为最大限度地提高转化率，复苏期中应温和地摇动细胞（< 225 r/min）。
如果带有 α 互补，请接 “ 用 X-gal 和 IPTG 筛选细菌菌落：α 互补”。
(17) 将适当体积（每个 90 mm 平板达 200 μl ) 已转化的感受态细胞转移到含 20 mmol/L MgSO4 和相应抗生素的 SOB 培养基上。
如果用四环素作为选择标记，全部的转化混合物可以铺在一个单独的平皿上（或软琼脂中），可以先在微量离心机上室温离心 20 s 以收集转化菌，在轻拍管壁的同时加入 100 μl SOC 重悬沉淀。
重要：玻璃铺菌器先需在乙醇中浸泡，然后在酒精灯上灼烧，待它凉至室温后，才可将转化菌轻轻地铺在琼脂板表面。
如检査氨芐青霉素的抗性，用转化菌铺平板时密度应较低（每个 90 mm 平板不超过 104 菌落 )，于 37℃ 培养的时间不超过 20 h。氰苄青霉素抗性的转化体可将 β-内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域的青霉素。这样，铺平板时密度过高或培养时间过长都会导致出现对氰苄青霉索敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用氨苄青霉素而用羧苄青霉素，以及将抗生素浓度从 60 μg/ml 提高到 100 μg/ml，可使情况有所改善，但不能彻底根除之。抗氨芐青霉素菌落的增加与平皿上所加的细菌数的增加并无线性比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细胞释放生长抑制物质的缘故。
(18) 将平板置于室温直至液体被吸收。
(19) 倒置平皿，于 37℃ 培养，12~16 h 后可出现菌落。
1. 缓冲液和溶液
(1) 甲亚砜 DMSO
二甲亚砜的氧化产物据推测为二甲硫醚，是转化的抑制物。
(2) DnD 溶液（DMSO 和 DTT)
DTT（二硫苏糖醇）1.53 g，DMSO 9 ml，1 mol/L 乙酸钾（pH 7.5) 100 μl，H2O 补至 10 ml。
DnD 溶液用可耐受有机溶剂的 Millex SR 膜（Millipore) 过滤除菌，将 DnD 溶液分装成 160 μl 小份放入 0.5 ml 的无菌微量离心管中，密封管口，贮存于 -20℃。
(3) 转化缓冲液
标准的转化缓冲液（TFB）一般现用现配。冻存的缓冲液（FSB）用来冻存（-70℃）感受态细胞。
2. 培养基
(1) SOB 琼脂板含 20 mmoI/L MgSO4 和适量的抗菌素
标准的 SOB 琼脂板含 10 mmoI/L MgSO4。
(2) SOB 培养基含 20 mmol/L MgSO4
标准的 SOB 培养基含 10 mmol/L MgSO4。
(3) SOC 培养基
每次转化反应需 1 ml 的 SOC 培养基。
3. 核酸和寡核苷酸
质粒 DNA （重组质粒）
4. 离心机和转头
Sorvall GSA 转头或与之相当的转头
5. 专用设备
(1) 液氮
(2) 预冷的聚丙烯离心管（50 ml）
(3) 预冷的聚丙烯离心管（17X100 mm；Falcom 2059）
(4) 预置的 42℃ 水浴
6. 载体和菌种
冻存的做转化用的大肠杆菌
该菌种需在 -70℃ 下保存。
二、方法
1. 细胞的制备
(1) 转化缓冲液的准备
若制备立即使用的惑受态细胞可用 TFB。若制备贮存于 -70℃ 的感受态细胞则用 FSB。来自配制转化缓冲液的水的有机物污染会降低感受态细胞的转化率。因此，采用直接从质量很好的 Milli-Q 过滤系统（Millipore) 取得的水将会得到满意的结果。假如出现问题，使用前可用活性炭处理去离子水。
① 制备标准转化缓冲液
A. 1mol/L 的MES 缓冲液的配制：将 19.52 g MES 溶于 80 ml 纯水（Milli-Q 级，或与之相当级别的）中，用 5 mol/L 的 KOH 调 pH 至 6.3，最后用纯水定容至 100 ml，用预先处理的 Nalgene 滤膜（0.45 μm 孔径）过滤除菌。以 10 ml/份分装，于 -20℃ 保存。
B. TBF 溶液的配制：将下表列出的成分溶解于 500 ml 水中，然后加 10 ml 1 mol/L 的 MES 缓冲液（pH 6.3)。最后用纯水定容至 1 L。
C. TFB 溶液用预先处理的 NaIgene 滤器（0.45 μm 孔径）过滤除菌，按 40 ml/份分装成小份贮存于组织培养瓶（Corning，或与之相当的瓶）中，并置于 4℃ 保存。
② 制备冻存缓冲液
A. 将 9.82 g 乙酸钾溶于 90 ml 纯水（Milli-Q 级或与之相当级别的）中制成 1 mol/L 的乙酸钾，然后用 2 mol/L 乙酸调 pH 值至 7.5，加纯水至终体积为 100 ml，将溶液分成小份，贮存于 -20℃。
B. 配制 FSB 溶液：用 500 ml 纯水将下表列出的所有成分溶解，待试剂溶解后，用 0.1 mol/L 的 HCl 调 pH 值至 6.4。如调过头，不要用碱重调，而应弃去溶液重配。用纯水将体积补至 1 L。
C. 溶液用预先处理的 Nalgene 滤膜（0.45 μm 孔径）过滤除菌。分装成 40 ml 小份，装入组织培养瓶（Corning 或与之相当的瓶）中贮存于 4℃。贮存期间，溶液的 pH 值将会下降至 6.1~6.2。此后，pH 值将稳定不变。
(2) 用无菌接种环直接从冻存的大肠杆菌贮存液中所需的菌种在 SOB 琼脂板表面划线，于 37℃ 培养 16 h。
没有必要将冻存菌融化，接种环划过冻存菌表面所带的菌已经足够了。一管冻存菌可以用多次。
(3) 将 4~5 个分隔良好的菌落转移到 1 ml 含 20 mmol/L MgSO4 的 SOB 中。中速振荡使细菌分散，然后在 1 L 锥形瓶中用 30~ 100 ml 含 20 mmol/L MgSO4 的 SOB 稀释培养物。
(4) 于 37℃ 将细菌培养 2.5~3 h，监测培养物的生长情况。
为达到高效转化，活细胞数务必少于 108 细胞/ml，对于大多数大肠杆菌来说，这相当于 OD600 值为 0.4 左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可毎隔 15 - 20 min 测定 OD600 值来监测，用检测的时间及 OD600 值列一个图表，以便预测培养物的 OD600 值达到 0.4 的培养时间，当 OD600 值达到 0.35 时，收集细菌培养物。
由于未明原因，在大肠杆菌的生长曲线上，有两个时期的大肠杆菌可以有较高的转化效率，一个在初期（OD600 =0.4）( Hunahan 1983)，另一个在末期（OD600=0.95）( Tang et al, 1994)。前期收获的菌容易有效是因为它的高转化率能持续的时间更长，而后期的生长峰较陡峭，在收集细菌时若稍耽误 2~3 min，将会使转化效率降低一个数量级。
在菌株与菌株之间，OD600 值与每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的 OD600 值，并将各稀择浓度的培养物铺于无抗生素的 LB 琼脂板以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度计读数得到标准化。
(5) 将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的 50 ml 聚丙烯管中，在冰上放置 10 min，使培养物冷却至 0℃。
(6) 于 4℃ 以 2700 g（用 Sorvall 转头相当于 4100 r/min）离心 10 min，回收细胞。
(7) 倒出培养液，将管倒置 1 min 以使最后残留的痕量培养液流尽。
(8) 用约 20 ml ( 每个 50 ml 管）冰冷的转化缓冲液（TFB 或 FSB)，重悬沉淀，将重悬细胞液冰浴 10 min。
(9) 于 4℃ 以 2700 g ( 用 Sorvall 转头相当于 4100 r/min) 离心 10 min，回收细胞。
(10) 倒出培养液，将管倒置 1 min 以使最后残留的痕量培养液流尽。
(11) 用 4 ml ( 每个 50 ml 管）冰冷的转化缓冲液（TFB 或 FSB ) 轻轻振荡，重悬沉淀。按步骤 (12) 第一部分给出的操作程序制备立即使用的感受态细胞，而步骤 (12) 第二部分制备贮存于 -70℃ 留待后用的感受态细胞。
2. 感受态细胞的制备
(12) 制备转化用的感受态细胞
① 新鲜感受态细胞的制备
A. 将 140 μl DnD 溶液加到每一细胞悬液的中心，立即轻轻旋转以混匀悬液，然后在冰上放置 15 min。
B. 每管再加 140 μl DnD 溶液，轻轻旋转以混匀悬液，再在冰上放置 15 min。
C. 将小份悬液分装到冷却的无菌聚丙稀管（17X100 mm) 中，将管置于冰上。
② 冻存感受态细胞的制备
A. 每 4 ml 重悬细胞液加 140 μl DMSO，轻轻旋转混匀之，将悬液置冰上 15 min。
B. 每份细胞悬液再加 140 μl DMSO，轻轻旋转混匀之，置冰上 15 min。
C. 迅速将悬液分装到冷却的无菌微量离心管或组织培养管中，封紧管口，没入液氮中快速冰冻感受态细胞。贮存于 -70℃ 备用。
D. 需要时，从 -70℃ 冰箱中取出一管感受态细胞，把管握于手心，融化细胞。细胞一经融化，立即把管转移至冰浴中，在冰上放置 10 min。
E. 用一冷的无菌吸头把感受态细胞转移到冷却的无菌聚丙烯管（17 X 170 mm) 中， 放置在冰浴上。
3. 转化
包括阳性和阴性对照。
(13). 将要转化的 DNA 片段加入到装有感受态细胞的管中（50 /4 感受态细胞需 25ngDNA)，体积不应超过感受态细胞的5%，轻轻旋转几次混匀内容物。实验中至少 设两个对照管：一个含有感受态细胞和已知量的超螺旋质粒DNA，另一管只有感 受态细胞。混匀内容物，冰浴 30 min。
(14) 将管放入预加温至 42℃ 的循环水中，恰恰放置 90 s，不要摇动管。
热激是一个关键步骤，准确地达到热激温度非常重要。这里的温度及温育的时间都是使用 Falcon 2059 管 的测量参数，其他类型的管将可能获得不同的结果。
(15) 快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却 1~2 min。
(16) 每管加 800 μl SOC 培养基，用水浴将培养基加温至 37℃，然后将管转移到设置为 37℃ 的摇床上，温育 45 min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
为最大限度地提高转化率，复苏期中应温和地摇动细胞（< 225 r/min）。
如果带有 α 互补，请接 “ 用 X-gal 和 IPTG 筛选细菌菌落：α 互补”。
(17) 将适当体积（每个 90 mm 平板达 200 μl ) 已转化的感受态细胞转移到含 20 mmol/L MgSO4 和相应抗生素的 SOB 培养基上。
如果用四环素作为选择标记，全部的转化混合物可以铺在一个单独的平皿上（或软琼脂中），可以先在微量离心机上室温离心 20 s 以收集转化菌，在轻拍管壁的同时加入 100 μl SOC 重悬沉淀。
重要：玻璃铺菌器先需在乙醇中浸泡，然后在酒精灯上灼烧，待它凉至室温后，才可将转化菌轻轻地铺在琼脂板表面。
如检査氨芐青霉素的抗性，用转化菌铺平板时密度应较低（每个 90 mm 平板不超过 104 菌落 )，于 37℃ 培养的时间不超过 20 h。氰苄青霉素抗性的转化体可将 β-内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域的青霉素。这样，铺平板时密度过高或培养时间过长都会导致出现对氰苄青霉索敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用氨苄青霉素而用羧苄青霉素，以及将抗生素浓度从 60 μg/ml 提高到 100 μg/ml，可使情况有所改善，但不能彻底根除之。抗氨芐青霉素菌落的增加与平皿上所加的细菌数的增加并无线性比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细胞释放生长抑制物质的缘故。
(18) 将平板置于室温直至液体被吸收。
(19) 倒置平皿，于 37℃ 培养，12~16 h 后可出现菌落。
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