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DNA实验

TILLING-高通量点突变筛选方法

2024-09-23 DNA实验 加入收藏
TILLING- 高通量点突变筛选方法反向遗传学方法是功能基因组研究的重要方法。为了克服传统的基因敲除方法的局限性,TILLING(Targeting Indu

TILLING- 高通量点突变筛选方法

反向遗传学方法是功能基因组研究的重要方法。为了克服传统的基因敲除方法的局限性,TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes)技术通过化学诱变的方法产生的大量点突变个体,可以对部分功能缺失的基因及基因分型中亚致死等位基因进行研究。

目前,TILLING技术已被大量应用于拟南芥、果蝇、玉米、斑马鱼、苜蓿等多个物种的研究领域。

Ecotilling- 高通量SNP 发现新方法

SNP可以用来研究物种间不同个体的遗传差异,疾病基因找寻,重要性状相关基因定位等。SNP的找寻需要获得大量个体DNA样本的序列信息,通过大规模测序,可以获得足够的序列信息,从而筛选出SNP。但是该方法耗费巨大,耗时较长。

Ecotilling技术的出现,解决了传统测序的缺陷,不仅分析速度更快,而且耗费很低,尤其适合大规模人群和动植物群体中找寻新的SNP位点,它和Tilling的区别是,Ecotilling使用的材料是自然环境中的群体,而非突变体,后续的实验技术流程与TILLING相同

高质量的的TILLING/Ecotilling图像

双色红外荧光检测,产生两个真实的凝胶电泳图像。未经加工的原始图像防止了突变被过滤得可能性。

双色检测消除假阳性结果

错配的异源双链经酶切后,产生两个片段。两个片段由不同的荧光标记(如右图)。泳道的两条突变片段分子量之和应该等于野生型的分子 量,满足条件方可以确定突变。

突变定位

成像程序可以识别存在突变样品位点的泳道并估算条带的分子量,进行突变位点的定位分析。

高灵敏度的红外检测

红外技术的高灵敏度避免了一些弱信号的丢失。与其他可见荧光相比较 ,红外技术具有更宽的动力学范围,弱的突变条带和强的野生条带同时生成高质量的图象。

技术成熟

我们所采用的Licor遗传分析系统是TILLING/Ecotilling技术的最佳选择。拟南芥Tilling计划(ATP)已经用Licor 4300找到了200多个基因的2000多株突变株。

拟南芥的TILLING流程操作示意图



经EMS处理后产生点突变的种子




第一代植株




自交产生的性状分离个体




提取植株DNA样本于96孔中




将8块微孔板样品合成一块,用两种红外标记的引物做PCR




PCR产物经变性和复性,野生型与突变型样品形成异源双链。




CEL I 核酸内切酶特异性切断错配的碱基




样本变性后在4300 DNA分析仪上电泳




在含有突变样本的泳道,野生型条带的下方可以观察到条带。700nm和800nm通道均可成像。




在混合的8个样本中进一步确定突变样本。


Ecotilling的流程从步骤4开始,没有诱变的过程。后续实验过程与TILLING相同。


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