消化管壁内神经丛的免疫细胞化学

第七节　消化管壁内神经丛的免疫细胞化学

胃肠道（包括胆囊及肝外胆道）的植物性神经分布有二个来源：①外源性神经（extrinsic nerve），指神经来自胃肠道以外的其它部位。②内源性神经（intrinsic nerve），指神经来自胃肠及胆道壁内的神经丛。要应用免疫细胞化学技术对消化道内源性神经进行研究，必须先了解消化管壁内神经丛的结构。

一、内源性神经的结构

内源性神经系指消化道的壁内神经丛。在胃肠道的壁内神经丛包括两个主要的神经丛：肌间神经丛（Auerbach丛）和粘膜下丛（Meissner丛）。有的作者建议将粘膜下丛分为：最近肠粘膜肌面的Meissner丛，最近环肌内表面的称Henel丛。现较普遍采取的Furnes 和Costa 的建议，将壁内神经丛分为粘膜丛、粘膜下丛、肌深丛、肌间神经丛和浆膜下丛。神经节　主要位于肌间神经丛和粘膜下丛。神经丛由神经节　和节　间连接来组成，节　间连接束连接散在分布、形状不规则的神经节　，组成图案样的网状结构。这些神经丛自食管下端的平滑肌部起，一直延伸到肛门的括约肌部，并与胆囊及肝外胆道的壁内神经丛相互连接，形成一个局部的神经系统。因此，早在19世界初期，Langley就建议将胃肠道这个局部的神经系统命名为肠道神经系统（enteric nervous sys－tem），并建议作为植物性神经系统中的，与交感和副交感神经系统并列的第三个部分。随着近代组织学技术的发展，大量实验资料证明，肠道神经系统的独特性，组织连接的复杂性和神经细胞类型的多样性，确实不同于其它两部分植物神经系统。

（一）神经丛的模式

在胃肠道及胆道的分层铺片，用镀银、甲基蓝、乙酰胆碱脂酶（Ache ）和菸碱腺嘌呤双核苷酸黄递酶（Nicotinamide adenine dinucleotide diaphorase , NADH）染色法，可以见到壁内神经丛的全貌。由于胃肠道各段神经节　的大小、形态不同，节　间连接束的粗细和长短的不同，神经丛的模式因胃肠道的不同部位、动物的种属不同而异。甚至在同一肠段，如结肠近腹膜附着方向，神经丛的分布远离腹膜附着的方向密集。胃小弯部神经丛的分布密集，神经节　较大，而胃大亦部神经的分布极少或无，胃肠道的粘膜下丛的神经节　小，分布较较稀疏，与胆道的神经丛相似。

（二）神经元的数目和大小

　　胃肠道各段的神经细胞密度（每平方厘米胃肠道壁所含的神经细胞数）也有不同，虽因染色方法和肠道扩张度的不同，各家报告数字略有不同。一般神经细胞的密度似与胃肠道肌层厚度有关。肌层愈厚，神经细胞密度愈高。在哺乳类动物，结肠的神经细胞密度较小肠高。动物愈大，神经节　分布愈稀疏，单位面积内的神经细胞也愈低。在出生后的发育过程中，肌间神经丛内的神经细胞逐渐增加。新生大鼠小肠神经细胞总数为420000，至成年时增为1850000。而在小肠的单位面积内的神经元数，在新生小鼠为64345个/cm 2 ，在成年仅为9405个/cm 2 。换而言之，神经细胞数的增长远远落后于肠道肌层的发育。至于出生后神经丛内新生神经细胞的来源，是通过神经细胞的分裂或其它细胞的分化还是一个有待探索的问题。

　　与其它植物性神经节　相比，壁内神经丛内神经细胞大小的变异较为明显。肌间神经丛内神经细胞大小的变异较粘膜下丛更为明显，如在大鼠盲肠的神经丛内，神经细胞的表面积为100～200μm 2 。小肠肌间神经丛内的小神经细胞明显多于大神经细胞，而在胃肠道其它各段，则以大神经细胞居多。神经细胞大小的变异是否代表不同功能的神经细胞亚群，尚不清楚。

（三）神经细胞的类型

依形态学分类：Dogiel建议将肠道神经元分为三种类型：

1、I型具有许多短的、不规则的树突和一根细而长的轴突。

2、II型有一个短而局限于节　内轴突和许多长的延伸到神经节　外的树突。

3、III型具有中等长短的树突，终止于同一或邻近的神经节　。

Dogiel认为I型属运动神经元，II型属感觉神经元。肠道神经节　内存在dogiel I型和II型细胞，还存在其它的中间型细胞，如在猫的粘膜下神经丛中，单极和双极的神经细胞占83%，多极的神经细胞占17%。这说明肠道神经细胞形态的多样性。然而对于其形态与功能的相关性，是否I型与II型分别代表感觉及运动神经元，多数学者持怀疑态度。

依所含化学物质分类：可分为含乙酰胆碱神经细胞、含胺神经细胞、含嘌呤核苷酸神经细胞和含多肽神经细胞。免疫细胞化学技术是显示含多肽神经细胞的有力工具。现已知在消化管壁内神经丛内含有血管活性肠肽、生长抑素、物质P和脑啡肽等多肽。用双重免疫染色法可证明一种以上的多肽共存于神经细胞内。

二、消化道全层铺片技术

用消化道切片结合免疫细胞化学染色固然能显示壁内神经丛的神经细胞及纤维。但由于壁内神经丛为扁平的网状结构，欲窥其全貌，则以消化道全层铺片技术进行免疫细胞化学染色效果最佳。消化道全层铺片在英文文献中通常称为whole mount stretch preparation，即整装撕片。即根据消化管壁内神经丛的结构特点，分纵层肌、环层肌、粘膜下层等分层撕开铺片，以暴露不同的壁内神经丛。以肠道为例，简述消化道的分层铺片技术。

　　动物麻醉后，用Zamboin’s液行主动脉灌注固定，剖腹取任何一段肠管放入上述固定液中4 ℃ 下3h，然后移至4%多聚甲醛液固定3h，再移至20%蔗糖4 ℃ 过夜，于次日行全层铺片。选择一大小适宜的吸管或玻棒穿入肠管，使其被动扩张，然后用钟表镊在肠系膜附着处沿肠管纵轴划痕，用镊尖沿划痕轻轻剥离分离纵肌层，将剥离的纵肌层放在载玻片上（浆膜面向下）。在解剖显微镜下，用镊尖轻挑去附于神经丛上的环层肌，即得纵、环肌之间的肌间神经丛。再将肠管的粘膜面向外翻套在吸管或玻棒上，用镊子或手术刀反复刮去表面的上皮层，即可获固有层表面的粘膜丛，重刮时刮去表面的粘膜层，即可暴露粘膜下层的粘膜下神经丛。

撕片放入0.1mmol/L的PBS溶液中，等待进行免疫染色。其步骤与切片染色同，只是由于撕片较厚，为增强抗体的穿透性，常于染色前在系列酒精中反复脱水后，再进行免疫染色。一般撕片进行免疫染色地漂浮法为佳，可增加壁内神经丛与抗血清的接触。如撕片数量少，为节　约抗血清也可用载片法，此时载玻片上需涂抹一层粘附剂如铬矾明胶或多聚赖氨酸，以免撕片在染色过程中脱落。