分子杂交

对于大的基因组，DNA 酶切图谱凭肉眼是分辨不开的（EB 染色），因为大小不等的分子呈现弥散分布，只有借助灵敏的放射性同位素（或其他化学发光物质），将靶 DNA 在凝胶上（膜上）的带型通过特定的探针与之杂交，转换成 X 光片上直观的带型，才能进行相关分析。

另外如果需要鉴定或寻找与已知 DNA 同源的 DNA 片段如：染色体步查、基因组文库的评价和利用、阳性克隆的分析鉴定、转基因拷贝数分析等也都需进行 DNA 的分子杂交实验。

实验目的：掌握同位素的操作及防护方法；掌握预杂交、探针的标记及分子杂交技术

实验原理：依据碱基配对原则，用放射性同位素标记的 DNA 探针，与固着在膜上的靶 DNA 杂交，经放射自显影，确定靶 DNA 的位置。

1．预杂交：膜上有许多没有结合 DNA 分子的地方，若不在杂交前用一些封闭剂结合位点，加入探针后，探针 DNA 分子将会结合在这些位点上，导致杂交背景深，预杂交的目的是用非特异性 DNA 分子（鲑精 DNA ）及其它高分子化合物（封闭剂）将待杂交膜中的非特异性位点封闭，从而减少杂交背景。

2．探针的标记：体外标记 DNA 或 RNA 的方法有多种，如：末端标记，随机引物标记，缺刻平移（nick translation ），体外转录（in vitro transcription）及各类 PCR 等。

这些方法有的是在特定位置标记核酸（5' 或 3' 末端），有的标记核酸分子内部的多个位点。有的产物是标记单链，有的产物是标记双链。有的方法产生一定长度的标记产物，有的得到的是长短不一的标记产物。

随机引物标记：在 DNA 聚合酶的作用下，寡核苷酸通过与单链的模板配对可以启动 DNA 的合成。如果寡核苷酸序列是不同的（heterogeneous ），引物中包含所有可能的随机序列（如 6 碱基引物则有 4 6 =4096 种），可以与任意模板序列相配对在许多位置形成杂交链，四种核苷酸底物中有一种是用同位素标记的，因而可产生均匀一致高比活放射性探针。

同位素标记的探针 DNA 的平均长度与引物的浓度成反比，The klenow fragment 去除了 E.coli DNA polymerase I 的 5 '→ 3 '的外切酶活性，具有 5 '→ 3 '的聚合酶活性及 3 '→ 5 ' 外切酶活性；

Primer：可通过用 DNase I 消化牛胸腺 DNA ，DNA 合成仪合成或直接从公司购买。同位素标记的探针 DNA 的平均长度与引物的浓度成反比 [=k/(lnPc)1/2 ，Pc 是引物的浓度 ] ，一般可产生约 400-600 bp 的标记产物。

模板DNA ：线状双链DNA 。环状 DNA 用限制性内切酶切成线状，再标记。用纯化的 DNA 片段作模板标记的探针与用完整的质粒作模板比较，可减少背景。

dNTPs ： 其中一种用放射性同位素标记

3．杂交：将标记好的探针，加到杂交液中，在一定（温度下）条件下，使探针与膜上的 DNA 杂交。

4．洗膜：用不同组成及离子强度的（严谨度）溶液，洗去膜上的封闭剂及非特异性杂交的探针

实验材料及试剂：已转移上 DNA 的尼龙膜，32P 标记的 dCTP ，随机引物，20 × SSC ，10%SDS ，X- 光片，显影液及定影液等

实验步骤：

1．预杂交：将尼龙膜在 2 × SSC 中浸湿，放入杂交袋或杂交管中，加入适量杂交液（杂交液浸没膜），赶气泡，封口，放入 65 ℃的杂交箱或恒温摇床中，预杂交 3hrs 以上，一般 6-12hrs 。

2．标记探针：

反应体系： 1-2blots(19.5 × 9.5cm 2 )

DNA100ng

dNTP 2.0μl

Random primer5.0μl

Klenow (1u/μl)1μl

α- dCTP* 1.0μl

add ddH2O to 17.0μl

先将水和 DNA 按反应体系所需的量取至一 1.5 毫升离心管中，混匀，短暂离心至管底，放至 100 ℃干浴中变性 10 min ，变性探针迅速置于冰浴上 5 min ，按反应体系将反应混合液（dNTP ，Random primer ，Klenow ）加入变性 DNA 中，在同位素操作台上，加入32P标记的 dNTP （α- 32P dCTP* ，放射性比活 >3000℃i/mmol ），30 ℃温育 3hrs 以上。