哺乳动物细胞抽提物中荧光素酶的测定实验

萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶，同时在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效率，检测灵敏度高。荧光素酶报告基因被广泛用于miRNA靶基因验证。

荧光素酶报告基因的原理在于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，可以将目的基因3’UTR区域构建至pGL3-basic载体中报告基因Luciferase的后面，构建荧光素酶质粒。然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰miRNA后，检测报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

1. 转染后 24-72 h, 室温下用不含钙盐和镁盐的磷酸盐缓冲液（PBS） 洗细胞 3 次。PBS 换液时要轻缓，因为有些哺乳动物细胞（如人胎肾 293 细胞）在剧烈吹打时很容易从培养皿上脱落下来。通常，荧光素酶基因在转染细胞中获得最大表达量的时间是 24-72 h。

2. 每个 100 mm 培养皿中的转染细胞，加入 lml 冰冷的裂解缓冲液。缓冲液轻轻旋转， 然后用橡胶棒把裂解细胞从培养皿上刮下来。细胞裂解物转移到 1.5 ml 离心管中。

3. 细胞裂解物在 4°C 以最大速度离心 5 min。把上清小心地转移到另一个新的 1.5 ml 离心管中。

4. 用 Bradford 测定等快速比色法确定裂解物的蛋白浓度。在测定蛋白浓度前，为了防止干扰，把 TritonX-100 的浓度稀释到小于等于 0.1%。这步中，细胞裂解液可以分成小份， 贮存在-70°C。虽然贮存在或-20°C 时，荧光素酶在裂解缓冲液中不稳定（Brasier et al.1989）， 但是在含 15%（V/V）甘油和 1%（m/V） 牛血淸白蛋白的缓冲液中，该酶可以在 4°C 安全贮存。

5. 敲打盛有裂解物的管子的管壁，轻轻使裂解物混合。室温下，在每个含有 360ul 荧光素酶测定缓冲液的荧光光度计管中加入 5-200ul 细胞裂解液。管子放入荧光光度计。

除了可使用荧光光度计测量荧光素酶活性，还有另一种方法在栏目替代方案：用闪烁计数器测量荧光素酶活性。

6. 测定开始，200ul 荧光素溶液加到荧光光度计管中，然后在室温测量 2-60s 时间内的光输出。測光输出时间的最佳长短要根据经验确定，而且与转染细胞的类型以及所用的特殊底物和荧光素酶有关。

7. 测定每个管子产生的相对光单位数，并确定测量的线性范围。使用适当量的细胞裂解蛋白，使它在随后测量中产生的值位于线性范围的中部。根据所研究启动子的强度以及每次实验的转染效率，所需蛋白的量会有变化。细胞裂解物中荧光素酶活性可以用相对光单位数或毫克表示。