载体质粒的抽提、纯化及检测

一、目的:

了解质粒抽提常用的方法和原理；掌握试剂盒制备质粒DNA 的法。

二、原理：

（一）质粒DNA 制备三个步骤：

1、细菌培养与质粒扩增

2、菌体收集和溶菌

3、质粒DNA分离

（二）方法介绍：

1、碱变性抽提法（SDS法）:主要是利用染色体DNA和质粒DNA碱性环境中变性和复性的差异来分离出质粒DNA。染色体DNA 分子量比较大，在碱性环境中（高pH）变性，双链解拆开，抽提时由于机械剪切力的作用，环状断裂成线状，当pH 恢复中性时，无法恢复成环状，就呈网状与蛋白质一起通过离心沉淀下来。

质粒DNA 分子量小，在碱性环境中（高pH），双链解旋，但不拆开,当pH恢复中性时，恢复成环状。由于分子量小，所以离心沉淀时，不下沉，保留在上清溶液中。

缺点：SDS 破细胞很厉害，小染色体片段和蛋白质比较多，后处理较困难。

２、酸酚法：主要是利用染色体DNA和质粒DNA 在酸性环境中变性和复性的差异来分离出质粒DNA。

染色体DNA 分子量比较大，在酸性环境中（低pH）变性，双链解拆开，抽提时由于机械剪切力的作用，环状断裂成线状，当pH 恢复中性时，无法恢复成环状，就呈网状与蛋白质一起通过离心沉淀下来。

质粒DNA 分子量小，在酸性环境中（低pH），双链解旋，但不拆开,当pH恢复中性时，恢复成环状。由于分子量小，所以离心沉淀时，不下沉，保留在上清溶液中。

缺点： pH 值太低会降解DNA， pH 的适度难以掌握，稍一偏差，全部DNA 被降解，什么也没抽到。现不常用。

3、溴化乙锭-氯化铯（CsCl)梯度离心法:

1）不同的氯化铯浓度和不同的离心时间会成为不同的密度梯度。

2）抽提破细胞后，蛋白质，染色体DNA，质粒DNA,RNA 全部释放出来，加入溴化乙锭（EB)，通过EB对不同物质的插入多少而形成不同的密度梯度。EB插入越多,密度越小。离心后，在离心管中从上到下（密度由小到大）形成的梯度区域带如下：

↓

蛋白质（密度最小）

染色体DNA（机械剪切力的作用断裂成线状，EB插入较多，密度较小）

质粒DNA-线状（EB 插入较多，密度较小）

质粒DNA-环状（EB 插入较少，密度较大）

质粒DNA-超螺旋（EB 插入少，密度大）

RNA（单链，EB 插入最少，密度最大）

↑

不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl 密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA 与蛋白质区分开来

优点：此法抽提的质粒DNA 高纯度。

缺点：1）要求高档的超速离心机。

2）成本高，氯化铯价格贵。

4.TritonX-100 抽提法：

TritonX-100为非离子极性剂，在溶液中不形成离子，破细胞比较温和。使用该试剂是为了破细胞时不要太激烈，只形成孔状破裂，使质粒DNA 释出（当然还有RNA和一些小片段的染色体DNA 和蛋白质），而不释出大片段的染色体DNA 。当离心时染色体DNA的大片段与细胞膜的网状碎片附在一起，与蛋白质一起被离心沉淀，而质粒DNA则留在上清。所以细胞膜破裂的程度是实验的关键。

然后使用苯酚与氯仿来祛除蛋白质。用无水乙醇沉淀回收质DNA。

优点：抽提的质粒比较纯，较好用, TritonX-100 不影响后续实验，可以大量抽提。

缺点：比试剂盒抽提时间要长