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DNA实验

SDS裂解法提取大量质粒

2024-10-15 DNA实验 加入收藏
本法的产量低得多,但却比其他方法更温和,是提取大质粒(大于15kb)的首选方法。试验步骤:1. 将500ml细菌沉淀物洗过后重悬于10ml用冰预冷的10%蔗糖、

本法的产量低得多,但却比其他方法更温和,是提取大质粒(大于15kb)的首选方法。

试验步骤:

1. 将500ml细菌沉淀物洗过后重悬于10ml用冰预冷的10%蔗糖、50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)溶液中,将悬液移至30ml的带盖螺口塑料试管中。

2. 加入2ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值小于8.0时,溶菌酶不能有效地发挥作用。

3. 加8ml 0.25mol/L EDTA(pH8.0), 将管倒置数次以混匀悬液, 在冰上放置10min。

4. 加4ml 10% SDS,用玻棒迅速混匀内容物,使SDS均匀分散到整个细菌悬液中,操作应尽可能温和小心,以便最大限度地避免释放出来的DNA受到剪切。

5. 立即加入6ml 5mol/L NaCl(终浓度为1mol/L), 再次用玻棒温和彻底地混匀内容物,在冰上放置至少1h。

6. 以4℃[用Beckman Ti50型转头(或与其相当的转头)],30 000rpm离心30min,小心将上清转移到一个50ml的一次性塑料离心管中,弃去沉淀物。如果细菌碎片未能全部除尽,可用35 000rpm再离心20min,将上清转移到另一管中,去掉存在离心管内的粘稠状液体。

7. 上清分别用酚/氯仿和氯仿各抽提1次。

8. 将水相转移到250ml的离心瓶中,于室温加入2倍体积的(约60ml )乙醇,充分混匀,室温下放置1-2h。

9. 以4℃,5000rpm离心20min,回收核酸。

10. 离心管倒置于纸巾上,使最后残存的乙醇流干,在真空干燥内短时间干燥沉淀物,但不要使之完全干燥。

11. 用3mlTE(pH8.0)溶解DNA。


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