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DNA实验

T4 DNA聚合酶

2024-05-22 DNA实验 加入收藏
材料与仪器DNATrish·Cl dNTP MgCl2 BSA DTT水浴锅步骤一、50 μl 反应体积:(1)50 mmol/l Tris·Cl,pH8.0


材料与仪器

DNA
Trish·Cl dNTP MgCl2 BSA DTT
水浴锅

步骤

一、50 μl 反应体积:

(1)50 mmol/l  Tris·Cl,pH8.0

(2)5 mmol/l  MgCl2

(3)5mmol/l  DTT

(4)100 μmol/l  4dNTP混合液

(5)50 μg/ml  BSA

(6)0.1 U  T4DNA聚合酶

(7)2 μg  DNA

(8)11℃温育20 min,加入2 μl 0.5 mol/l EDTA或75℃加热10 min以终止反应。

(9)反应体枳、4种dNTp的浓度、反应温度可依具体应用而变。
 
二、dNTp浓度的效应
 
1.  高浓度的dNTP在通常实验下可以增加聚合酶活性对外切酶活性的比值。

2.  在标记实验中,标记了dNTP的浓度降至1到2 μmol/l,但标记dNTP不能低于1 μmol/l 浓度,否则当dNTP耗竭时,会导致其外切酶活性对的降解。
 
三、度的效应
 
用T4 DNA聚合酶标记3’末端时,反应温度保持在11℃,在较髙温度下,其外切酶活性易降解DNA模板。

常见问题

一、缓冲系统的相容性
 
许多限制性内切酶能在T4 DNA聚合酶的缓冲系统进行切割反应,同时,T4 DNA 聚合酶也能直接使用。

二、应用
 
1.  放射性标记DNA片段的3’末端,含5’凸出端的DNA片段及浓度为1~2 μmol/l 的适当[α-32P]dNTP,在11℃温育20 min。
 
2.  选择性及无选择标记线性化双链DNA分子的3’宋端,即所谓的“置换合成”。双链 DNA片段在dNTP存在下与T4 聚合酶温育,其3’末瑞的外切酶活性导致从 3’末端降解DNA,当补加4种dNTP后,可激活其聚合酶活性,延伸DNA镆板的3’末端。在T4 DNA聚合酶的外切酶活性降解了30~40%外模板时加入4种dNTP混合液,可获得最隹标记效果。

3.  变双链DNA的粘性末端成平端,便于平端克隆。在髙浓度4dNTP种存在下,酶促的 降解终止于双链区,类似地,如果末端存在5‘凸出,酶将延伸凹进陷的3’端直至与5’端平齐。在实际应用中,DNA与T4 DNA聚合酶和浓度各100 μmol/l dNTP在温育20 min。 


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