CRISPR技术分享

近年来，CRISPR技术掀起了基因组编辑的热潮。短短一年间，CRISPR技术已登上了数个知名榜单，包括Science的十大科学突破，Nature Methods的值得关注技术，以及Technology Review的十大突破技术。利用CRISPR技术发表的文章更是层出不穷。今天就和大家分享下CRISPR实验的主要步骤及需要考虑的因素。第一步，你要确定你做CRISPR的目的，即选一个CRISPR系统你要考虑清楚为什么要使用CRISPR系统，是破坏目的基因，还是编辑或修饰目的基因？不同的目的需要通过不同的修复途径来实现。两者的区别主要在于是否引入了包含外源DNA的修复模板。若只是破坏目的基因，Cas9在基因组DNA上产生的双链断链（DSB）通过非同源末端连接（NHEJ）途径进行修复。这个过程会在DSB位点随机插入或删除几个核苷酸，从而带来插入缺失（Indel）。Indel可能改变目的基因的开放阅读框，从而改变DSB下游的氨基酸序列；也可能会引入提前终止密码子，从而破坏目的基因。由于Indel是随机的，因此需要通过实验来确定基因破坏的类型和程度。若是编辑或修饰目的基因，则一般利用同源修复（HR）。当合适的模板存在时，HR能在Cas9诱导的DSB上引入特定的核苷酸修饰。同样，这个修饰也必须通过实验来证实。第二步，设计gRNA在基因组DNA中选择适当的目标序列，这对实验设计来说是非常重要的一步。网上有许多关于gRNA设计的心得，这里就不多说了。第三步，将gRNA克隆到质粒中，导入CRISPR元件克隆即普通的克隆。克隆完通过测序来验证最终的质粒产物。这一切看上去并不复杂，但若是自己动手设计，恐怕也不轻松。现在市场上一些公司已经推出了商业化的CRISPR/Cas9载体，将这些必要的元件组合成单个载体，简化了实验设计，例如GeneCopoeia。第四步，导入CRISPR元件在导入CRISPR元件时，若使用的是哺乳动物细胞普通的细胞系（如HeLa、HEK 293），那么常用的DNA导入方法都可以使用，如转染、病毒导入。而对于ES细胞和iPS细胞，电穿孔的方法效果会更好。对于原代细胞，病毒转导可能更理想。第五步，评估效果这又要回到实验目的了。如果你是选择修饰目的基因，那在设计所引入的外源序列时，可以加入示踪基因。如果是选择破坏目的基因，那你可以选择一些检测试剂盒。比如GeneCopoeia的IndelCheck™ CRISPR/TALEN 插入缺失检测试剂盒。其采用错配检测内切酶来检测细胞内NHEJ修复期间因插入或删除而产生的插入或缺失。试剂盒简便快捷，性价比高。当然，你也可以通过测序对序列进行验证。