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DNA实验

cDNA文库的构建和筛选 —在外界环境压力条件下，新表达基因的鉴定方法实验

cDNA文库

2024-05-30 DNA实验加入收藏

材料与仪器步骤一、材料所有化学试剂均为分子生物学级纯度。所用塑料和玻璃制品，包括瓶子和移液器吸头均经高压蒸气灭菌。涉及核酸的操作均需带手套。1.总 RNA提取（

材料与仪器

步骤

一、材料

所有化学试剂均为分子生物学级纯度。所用塑料和玻璃制品，包括瓶子和移液器吸头均经高压蒸气灭菌。涉及核酸的操作均需带手套。

1.总 RNA提取

（1）无 RNase 水。加 I mL 焦炭酸二乙酯（DEPC) (Sigma-Aldrich) 到 I L 水中(0.1%， V/V) , 搅拌过夜（> 1 2 h)，高压蒸气灭菌。这可使得存在于水中的RNase 失活，处理过的水用于本节中溶液的配制和溶解 RNA 样品。

（2）TRIzo〖试剂（Invitrogen)。

（3）氣仿（Fisher Scientific)。

（4）异丙醇（Fisher Scientific)。

（5）7 0 % 乙醇，加 30 mL DEPC 处理的水至 70 mL 无水乙醇中。

（6）Oligo (dT) 纤维素（New England BioLabs， NEB)。干燥的 Oligo (dT) 纤维素与 0 •I mol/L NaOH 混合使其成浆状，填充入一个无菌的柱子或 I mL 灭菌棉花或者玻璃丝塞住的注射器。在加样前先用上样缓冲液平衡柱子。

（7）上样缓冲液： lm ol/LNaCl， 2 mmol/L 磷酸缓冲液， PH7.2。

（8）洗漆缓冲液（middle wash buffer) : 上样缓冲液+0.3 mol,+LNaCl。

（9）洗脱缓冲液（elution buffer): 10 mmol/L Tris——HCl， pH7. 2〜7. 4 ， I mmol/LEDTA

（10）3 mol/L 乙酸钠， pH 5. 2。

（11）乙醇。

2 cDNA 文库的构建

$1. cDNA文库构建的克隆载体。现已有许多载体，各有其特别的用途，研究者应根据其特性挑选恰当的载体。一些使用较广泛的 cDNA文库构建载体包括: Uni-ZAPXR (Stratagene)、 plTriplEx2 (Clontech)、 pSPORTl (Invitrogen)、 130^££1^-1(1^〇¥&8611/]\46]：〇 10。本章将以1711卜2八？父1^克隆载体为例。 2. 1/xg经过柱纯化的mRNA。 3 . 含多聚（ dT) 区域的寡聚核苷酸连接物 - 引物（ linkerprimer) [例如 5'- NNNNNNNNCTCGAGdT (15) -3’] 。 4. 核糖核酸酶抑制剂（ RNasin， 2 0 U//iL ; Pr〇 mega)。 5. AMV反转录酶（10 U" L) 和 IOX反转录缓冲液（ Promega)。 6 . 核苷酸（ dATP、 dTTP、 dGTP 各 l 〇 mmol/L)。 7. 5-甲基胞嘧啶类似物（dCTP~J_5_mmol._~9_L~B。 8. RNase H (5 U '/ uL; New England Biolabs)。$
$9. DNA 聚合酶 I CE.coU; 10 U/^L) 和 IOXDNA 聚合酶 I 缓冲液（ New England Biolabs) 〇 10. E coR I接头。 E coR I接头可购买得到，也可用两个不同长度的引物构建，经过杂交可形成双链并在平末端带有5'-鱗酸基。在一条引物上包含一个有 E coR I酶切位点的5'-AATTCNNN-3'突出末端。双链的另一端（接头的平末端）可连接至任何包含憐酸基团的 cDNA末端。接头应用蒸馏水稀释至终浓度为5 fig/^L 。 11.50\丁八丑缓冲液： 2 111〇 1/[1'1^-乙酸口《 ^ . 5 ， 100 111111〇 1/1^〇丁八。 12. 1 % T A E 琼脂糖凝胶： IX T A E 缓冲液， 1 % 琼脂糖（ lg/lOOmL)，溴乙锭（1 fig/mL)〇 13. 100 mmol/L EDTA。 14. T4 DNA 连接酶（400 U/V L) 和 IOXT4 DNA 连接酶缓冲液（ New England Biolabs)。 15. T4多聚核昔酸激酶（ polynucleotide kinase， 10 U/juL) 和 IOXT4多聚核苷酸激酶缓冲液（ New England Biolabs)。 16. TSM 缓冲液： 50 mmol/L Tris-H Q ， ::pH 7. 5， 100 mmol/L NaCl， 8 mmol/L MgSO4, 0.01% (W/V ) 胶原。 17. XLl-Blue (Stratagene)0 18. LB■氨苄青霉素肉汤： IO g蛋白胨， 5 g 酵母抽提物， 5 gNaCl， pH 7. 5 , 用双、蒸水稀释定容至1 L ，高压蒸气灭菌。冷却至室温后，添加 0 . 2 % 的麦芽糖和终浓度为1〇〇 fxg/m L的氨苄青霉素。 19. NZY 琼脂： 5 gNaCl， 2 gM gS0 4 .7H20, IOg 蛋白胨， 5 g 酵母抽提物， I5 g 琼脂粉， pH 7. 5。用双蒸水稀释定容至1 L ，高压蒸气灭菌。冷却至 5〇 »〇铺平板，储存于4°C 。 20. N ZY上层琼月旨： 5 g NaCl, 2 g MgSO4 • 7H20, I g/L 蛋白陈， 5 g 酵母抽提物， 0.7% (W A O 琼脂粉， pH 7. 5。用双蒸水稀释定容至i l ，高压蒸气灭菌。上层琼脂储存于4°C 。在使用前用微波炉融化。在接种细菌培养前，必须冷却至45°C 以下。 ’ ' 21. 高保真聚合酶（2.5 U/ML ， Stratagene)。$

3 CDNA 文库的扩增

（1）NZY 平板（24 cmX24 cm )， LB-氛卞青霉素肉汤， XLl-Blue 菌种， NZY 琼脂，NZY 上层琼脂（见 2 中第 19、 20 项）。

（2）TSM 缓冲液（见 2 中第 16 项）。

（3）氯仿（Fisher Scientific)。

（4）二甲亚讽（DMSO; Sigma-Aldrich)。

4 cDNA 文库差异表达的筛选

（1） NZY 平板（24 cmX24 cm, 见 2 中第 19、 20 项）

（2）Hybond-14 0.45/1111 孔径的尼龙膜（GE Healthcare)。

（3）20XSSC: 3 mol/L NaCl， 0. 3 mol/L 柠檬酸钠（I L 配方： 175 g NaCl， 88 g柠檬酸钠）；用蒸馏水稀释。

（4）变性缓冲液： I.5 mol/L NaCl, 0. 5 mol/L NaOH。

（5）中和缓冲液： I. 5 mol/L NaCl, 0. 5 mol/L Tris-HCl， pH 8. 0。

（6）冲洗缓冲液： 0.2mol/LTris-HCl， p H 8. 0, 2XSSC。

（7）Whatman 滤纸或层析纸（Fisher Scientific)。

（8）dNTPs (dATP、 dTTP、 dGTP 各 1 0 mmol/L)。

（9）固定的 Oligo (dT) 引物： 5’ - dT (15) A/G/C-3、可购买商业化产品（Invitrogen； New England Biolabs) 〇

（10）Nasin (20 U/μL, Promega)

（11）二硫苏糖醇（DTT) (Sigma-Aldrich)，用无菌水配置成〇• I m ol/L 储存液。

（12）A M V 反转录酶（10 U/μL) 和 10X 反转录缓冲液（Promega)。

（13）[α-32P] dCTP (3000 Ci/mol; GE Healthcare) 。

（14）RNaseA (60 mg/mL, Sigma-Aldrich)0

（15）快速离心柱（quick spin column) (TE; Sephadex 0 2 5 ， Fine)，用于放射性标记的 DNA 纯化（Roche)。

（16）IX T wEl 缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0 ， I mmol/L EDTA。

（17）杂交缓冲液，改良的 Church’s 缓冲液： 0.25 mol/L Na2 HPO4, 0.25 mol/LNaH2 PO4 (PH 7. 5)， lmmol/LED TA， 7 % 十二烷基磺酸钠（SDS; W/V );或够买商业化的缓冲液； Ultrahybe (Ambion)。

（18）洗膜缓冲液（membrane washing buffer): 0. 1XSSC， 0 •1 % SDS (W/ V)。

（19）膜清洗缓冲液（membrane rinsing buffer): 0.1 X SSC。

（20）X 光片（Koda)。

(21)TSM 缓冲液：（见 2 中第 16 项）。

(22)氯仿（Fisher Scientific)。

(23)XLl-Blue 培养基。

(24) N ZY 上层琼脂（见 2 中第 19、 20 项）。

5菌体内克隆的检出

(1)XLl-Blue 菌种。

(2)10 mmol/L MgSO4。

(3)ExAssist helper 嗤菌体。

(4)Uni-ZAP X R 噬菌体储存液。

(5)LB- 氨苄青霉素肉汤（见 2 中第 18 项）。

(6)SOLR 细胞。

(7)L B 氨苄青霉素琼脂平板： 15 g 琼脂粉加至 L B 肉汤中（I L)，高压蒸气灭菌。冷却至 50°C 以下铺平板，加人氨苄西林（lOOpg/mL) , 用恰当厚度铺板。

6 质粒的小量抽提

（1）LB-氨苄青霉素肉汤（见 2. 2 中第 18 项）。

（2）预裂解缓冲液： 5 0 mmol/L 葡萄糖， 2 5 mmol, LTris-HC1， p H 8. 0, lOmmol/LEDTA

（3）RNase A (见 4 中第 14 项）。

（4）碱裂解缓冲液：0. 2 mol/LNaOH， 1% S D S , 该溶液需用之前新鲜配制。

（5）中和缓冲液： 5 m olZL 乙酸钾， 30% 乙酸， 50 mm 〇 r L 葡萄糖， 25 mmol/LTris-HCl， pH 8. 0， 10 mmol/L EDTA0

（6）异丙醇（FisherScientific)

7.70% 乙醇（见 2. 1 中第 5 项）。

7 插入序列的分离

（1）限制性内切酶： E co R I 和 Xho I (N ew EnglandBiolabs); 可根据接头调节。

（2）IOX 限制性内切酶缓冲液，使用限制酶所附带的缓冲液。

（3）DNA 上样缓冲液：0. 25% (W /V ) 二甲苯氰， 0. 25% (W / V ) 溴酚蓝， 50% 甘油。

（4）1% T A E 琼脂胶和 50X T A E 缓冲液（见 2. 2 中第 11、 12 项

（5）DNA 分子质量标准（Invitrogen)，由表达克隆片段的大小而定（从 100 bp 到几kb)。

（6）带滤芯的移液器吸头（Im L )。

（7）灭菌棉花或玻璃丝。

8 标记探针的合成

9 Northern 印迹

（1）10X MOPS 缓冲液： 200 mmol/L MOPS， 50 mmol/L 乙酸納， 10 mmol/L EDT A , pH 7. 0。

（2）I. 25% 甲醛变性胶：将 3.75 g 琼脂糖溶于 217 m L 双蒸水中，加 E B 至终浓度 Iμg / m L , 将该溶液放置于 60°C 培养箱中。另取一灭菌瓶，加人 30 mL IOX MOPS 缓冲液， 53 mL (37% , W ) 甲醛，将该溶液放人 60°C 培养箱中。等到两种溶液都平衡至 6 〇°C 后，将它们混合，轻轻旋转混勻，注意不要产生气泡，倒入较大的制胶板中。

（3）RNA 样品溶解缓冲液： IXMOPS 缓冲液， 2.2 mol/L 甲醛， 5 0 % 甲酰氨（V/V )。

（4）6X R N A 上样缓冲液： I X MOPS 缓冲液， 5 0 % 甲酰氨（V/V )， 4 0 % 甘油(V/V )，加入几滴溴酸蓝和二甲苯氰作为示踪染料。

（5）HybondO.45 pm 孔径的尼龙膜（GE Healthcare)。

（6）20XSSC (见 4 中第 3 项），必要时用蒸馏水稀释至所需浓度。

（7）Whatman 滤纸或层析纸（Fisher Scientific)。

（8）纸巾。

（9）测序胶板。

（10）压重物。

（11）玻璃或塑料吸管（5 或 IOmL) , 用来驱除转膜装置中的气泡。

（12）塑料薄膜。

（13）Northern 印迹法的固定液： 0 •05 mol/L NaOH。

1 0 用探针检测 Northern 印迹

（1）杂交液： Ultrahybe 杂交缓冲液或者改良的 Church』 s 缓冲液（见 4 中第 17项)。

（2）放射性标记的探针（见 2. 8)。

（3）Northern 杂交洗液：用蒸馏水配置 0. 1XSSC， 0.1% SDS。

（4）X 光片。

（5）Northern 印迹洗脱液：煮沸含有 0.5% SDS 的双蒸水，将印记膜放入，用盖革计数器检测直至放射信号低于背景水平。

二、方法

已有针对特定的实验（基因的高或低拷贝等）而设计的商业化产品来检测和鉴定差异表达的基因。尽管技术的发展日新月异，但从感兴趣的组织/器官/有机体中分离mRNA 构建 cDNA 文库仍然是鉴定新基因和蛋白质的标准方法。有很多成熟的试剂和产品可供选择来构建一个文库；本章介绍了一种通用的标准方法用于构建文库，筛选阳性克隆并对其分析。这些实验方法使用了 Uni-Zap-cDNA 合成试剂盒（Stmtagene)(5)，但也可以修改后用于其他载体。一些通用的噬菌体克隆载体包括 plTriplEX(Clontech)、 pSPORTl (Invitrgen) 和 ISCREEN-1 (Novagen) , 但不局限于这几种。文库构建之后，用表达差异筛选来鉴定在测试条件下受诱导或抑制的基因克隆。这里我们以新基因的鉴定为例说明具体的实验步骤，该基因在海蜗牛的肝胰腺组织中表达，并在缺氧条件下被诱导。这种表达上调被 Northern 印迹所证实。似印-2克隆的序列测定后，进一步的序列分析参见 3. 11。

1 总 RNA 的提取分离

（1）现今有许多试剂盒可用于总 RN A 和 mRNA 的分离（Ambion、 Roche、 Qiagen、Invitrogen、 Novagen 等）。这些试剂盒可获得高纯度和高质量的 RNA，但相对来说价格较贵。这里我们介绍了传统常规的 RN A 抽提方法。

（2）每 100 mg 组织加入 Im L TRIz0I 匀浆，并加入 0.2 m L’ m L 氯仿。颠倒混匀 15s，室温放置 2〜3 min。 4： ° C ， 12 000 g■离心 15 min。

（3）转移上层水相至一新的 Eppendorf 管，加入等体积的异丙醇沉淀 RNA。在室温放置 10 min。

（4）4°C ，最高转速离心 10 min。移去上清，用 250 pL 7 0 % 乙醇洗涤沉淀，最高转速离心 5 min。吸去乙醇，在室温空气干燥 RNA 10 min, 用适量的 DEPC 处理的水溶解（假定 10 mg 组织获得的 RNA 量为 IOfXg)。储存于 4°C (一周之内）或者一 20°C (长期保存)。

（5）用紫外分光光度计测定 260 nm 和 280 mn 光吸收值，用以确定 RN A 浓度和纯度。 A260/A 280 为 1. 6〜2. 0 为可接受的范围（见注释 1)。

（6）用结合有 Oligo (dT) 的纤维素柱子纯化 poly (A )+ InRNA。总 R N A 加热至65°C ，与上样缓冲液 1 : 1 混合（V/V )，上样至 Olig0 (dT) 的纤维素柱。

（7）用一个柱床体积的上样缓冲液冲洗柱子，收集洗脱液于无菌 Eppendorf 管。将洗脱液再上样、收集，重复两次。

（8）分别用一个柱床体积的上样缓冲液和洗涤缓冲液冲洗柱子，最后用 1.5 倍柱床体积的洗脱液洗脱。最后一步使 poly (A )+ InRNA 得以洗脱，加入0.1 倍体积的 3 mOl/L 乙酸钠（p H 5•2)， 2•5 倍体积的无水乙醇，放置于一 20。 C 沉淀过夜。操作程序可在此停止。

（9）第二天于 4°C , 13 000 g 离心 45 min。弃上清用 7 0 % 乙醇洗涤（250 fxL), 以相同速度离心 10 min。所获得的沉淀为 mRNA, 空气干燥并溶于 DEPC 处理的水中（见注释 2)。如果不立即用 mRNA 进行实验，则将样品储存于一 8 〇°C 。

2 cDNA 文库的合成

以上述条件再离心5 min，转移水相至新的Eppendorf管。 6•加人等体积异丙醇，加乙酸钠至终浓度为0.1 mol/L 。放置反应管于一20°C沉淀 cD N A 过夜。实验步骤可在此处暂停。 7 . 第二天于4°C ，最大速度离心I h 沉淀 cD N A 。转移上清至另一离心管，确认获得的沉淀是cD N A 。用盖革计数器确定c D N A 沉淀有放射标记，再测定上清确认大部分放射活性存在于沉淀中。 8•加入7 0 % 乙醇洗涤沉淀（250 ( L i)，在微型离心机上用最大转速于室温离心10 min, 小心移除乙醇，当心不要扰动沉淀，室温空气干燥10 min。沉淀位置用笔在管外部做上标记，因为干燥后沉淀会“消失”。 9. 在无菌水（ IOfJ J 中重新溶解cDNA沉淀，轻弹样品，稍加离心收集样品于离心管底部。将离心管静置于室温10 min或 4°C , 30 min使 cDNA充分溶解。转移 cDNA溶液至一新的离心管，用盖革计数器检测旧离心管，确定 cDNA已被完全溶解（见注释4)。 1 0 . 加人 T 4 D N A 连接酶（ 5 U ) 和 I O X T 4 D N A 连接酶缓冲液（ 1, 5 ML ) 将 Ec0R I 接头连接到平末端。反应终体积为15 (加蒸馏水补足）。在 10°C反应 16 h 。 11. 将离心管放置于75°C，反应 15 min以热灭活连接酶，稍加离心，收集反应液于管底。将该样品放置于冰上，加入如下试剂： T 4多聚核苷酸激酶（10 U ) ， 10XT4多聚核苷酸激酶缓冲液（0.5 ^L) , 加无菌水将反应终体积补至20 pL。 37°(：孵育3〇 111丨 11，随后于75°(：反应15 111;11以热灭活激酶。稍加离心，收集反应液于管底，将该离心管放置于冰上。 12■加入4 IOX内切酶反应酶缓冲液， 10 p L 灭菌蒸馏水， 6 X/w I 内切酶至 cDNA管中（使终体积为40 f/L)，用以切开位于连接物-引物上的； I 酶切位点。轻弹混匀，稍加离心，收集反应液于管底，在 37°C孵育 2 h。加人等体积异丙醇，放置于一20°C沉淀过夜（见注释5)。 13. 在微型离心机上用最大转速于4° C离心 10 min，小心移除上清，当心不要扰动沉淀。 14. 加人 7〇 %乙醇洗涤沉淀（250 fzL)，在离心机上用最大转速于4°C离心 10 m in。小心移除乙醇，室温空气干燥10 min (见注释 6)。用适当体积的无菌蒸馏水 (本例中我们使用了 50 ML) 重新溶解沉淀，于 4°C保存。 15•制备10 mL 1 % T A E 的琼脂糖凝胶，倒人 10 cm的制胶板，等待其聚合。在胶底部标记出10个方形网格。 16•用100 mmol'L 的 EDTA溶液倍比稀释（从 10 ng/fxL到 250 ng/j^L) 已知浓度的DNA标准品（如 2. 7. 5 中的DNA分子质量标准)。 17•在每一稀释度作一标记（〇、 5、 10、 25、 50、 75、 100、 150、 200、 250 ng' VL)。 18•从每一稀释度中仔细吸取1 卩 L 到胶板上。 19•在每一稀释度下方，点样 I fxL cD N A 样品，放置大约20 m in使其渗透入胶板中。 20.用紫外线照射平板，观察 cDNA样品，与标准品相比估计其浓度。 21•将cDNA (〜100 ng)、带有黏末端的载体（1网 )、 IOXDNA连接酶反应缓冲

3 滴度测定和 cDNA 文库扩增

4 cDNA 文库的差异筛选

6•取第二张膜，重复步骤3〜5 , 吸收时间延长至2 min。 7•将尼龙膜放置于两张滤纸中间，于干胶仪中80°C 烘烤。 8. 需合成两套探针来筛选。一套用对照mRNA为模板合成，另一套则以暴露于环境压力中的mRNA为模板。 9. 用与第一链cDNA合成类似的操作方法合成探针，（见 3. 2，材料列于2. 2)。分装 poly (A )+ mRNA (约 1 辟）入 DEPC处理的 1.5 m L离心管， 65°C 加热 5 min0 10. 立即置于冰上，随后各管分别加人IOX反转录酶缓冲液（5 ^ ) 、 dNTPs (3 / iL 、无 dCTP)、 Oligo (dT) 引物（3 jug)、 RNasin (5 pL)。补水至 40 / xL，轻弹混匀，稍加离心收集液体于离心管底部，在室温退火10 min，使引物结合至 mRNA模板。 11. 加 5 juL 反转录酶和 5 juL [cr32P] dCTP (3000 Ci/mol) 至各管， 42°C孵育 I h 后，将离心管转移至16°C水浴。 12. 为降解RNA，需加人RNase A 5 ( ixL并于 37°C孵育 30 mm。经此处理后离心管内只剩下cDNA，将其上样至快速离心柱， 400 g•离心3 min。洗脱液（放射标记的cDNA) 即可用作探针与尼龙膜杂交。 13. 结合有噬菌斑的膜放置于55°C 的旋转杂交管中在杂交液中预杂交30 min。 14•把放射标记的探针煮沸5 min (见注释8)，立即置于冰上。将探针直接加入现有的杂交液中（见注释9 ) 至终浓度为l X 10scpm/mL。为便于比较，需加人等同的放射标记量至匹配的印迹膜上（对照和实验组），在 45°C 下滚动杂交过夜（〜16 h)。 15. 杂交后，用0.2父33(：， 0 . 1 % ( 灰 / ^)3〇 3溶液于 55。〇洗涤杂交膜10 111丨 11 ，再重复该洗涤步骤3 次以降低放射背景。如果背景仍然很高（用手持式盖革计数器测量），可重复该洗涤步骤。 16. 将洗涤过的膜保持湿润，有放射活性的一面朝下，放置于塑料薄膜上，封口使液体不至漏出。用薄膜再次包裹杂交膜。用纸巾抚平表面（除去折皱和气泡）。将杂交印迹曝光于X 光胶片（或成像憐屏）适当的时间，其时间取决于特异性探针结合于杂交膜的cpm值。 17. 曝光X 光胶片，并分析放射自显影结果。图 I A 为第一次筛选的放射自显影结果。每一点代表一个探针结合的噬菌斑。 18. 根据定位标记，回到 N ZY平板上找出对应于差异表达克隆的噬菌斑并剪下。用一灭菌的巴斯德管剪切下各个斑点的琼脂块，放置于加有500 ML TSM 缓冲液的 I.5 mL Eppendorf管中。如果不能分离出单个克隆（特别在初次筛选时），将推定的大致阳性“区域 “切下。 19. 每管加入氯仿（至 5 % ， W/V )，振荡混匀30 s, 在室温放置30 min，使得噬菌体从琼脂释放至缓冲液中。 20_将以上样品在4°C ， 3OOOg 离心 5 min, 转移上清至一新的离心管（包含游离的噬菌体），存放于4°C 。 21.测定每一转移噬菌斑的滴度（试11/1111)(见 3.3)。

22•按50〜100 pfu/平板的水平将每一阳性克隆重新铺板于NZY平板（10 cm直径）。 23.用一小的圆形尼龙膜重新做第二次噬菌斑筛选，方法与初次筛选相同（从第 3 步开始）。用同样的方法重复差异筛选步骤（从第 8 步开始V。通过检查放射自显影图谱，选择代表感兴趣基因（具有差异表达）的阳性克隆。图 I B 为第二次筛选的放射自显影图谱。图 I cDNA文库的表达差异筛选。（ A) 初次差异筛选使用以海蜗牛（ Lto0WmZii0- mz) 的肝胰腺组织的mRNA为来源合成的 [32P ] d C T P 掺入的 cDNA。正常氧含量组：试验动物处于4°C正常氧含量环境。低压氧组：试验动物处于一个大气压的氮气环境中，持续时间为l h 、 1 2 h、 2 4 h (将来源于各时间点的等量的mRNA混合）。 (B) 第二次差异筛选，用相同的探针筛选假定的缺氧反应克隆。（ C) 从噬菌体上切割质粒载体，随后从细菌中对质粒进行纯化。可分离缺氧诱导的阳性克隆插人片段。第一泳道为编码蜗牛缺氧响应蛋白2 (snail anoxia-responsive protein 2，似印-幻的质粒克隆；各类非特异性的基因插人显示于随后几个泳道。阳性克隆需用Northern印迹确证其差异表达，随后进一步的鉴定如图2 所示