E. coli K-12限制外源DNA

E．coli有几种机制可以辨别并破坏外源DNA。但这也成为克隆实验的重要问题，因为其导致了所要序列的回收量大大减少。这一问题可以使用通过突变关掉这些机制的菌株来避免。一个限制作用完全缺失的菌株需要缺失hsd、mcrA、mcrBC和mrr位点(见后)。特异性：由hsdRMS基因编码的EcoKI限制会攻击在合适的酶切点(AAC[N6A]GTGC或GCAC[N6A]GTT)上未受腺嘌呤甲基化保护的DNA(1)。由mcrA、mcrBC和mrr编码的McrA、McrBC以及Mrr是需要甲基化的系统(2-6)，只有在特定的位置被甲基化时攻击DNA。后三个系统均是通过CpG甲基转移酶(M.SssI)修饰DNA，即甲基化CpG二核苷酸中的胞嘧啶(5)。在特定的序列中，Mrr也会攻击含甲基化腺嘌呤的DNA(4，6)。大部分常用的大肠杆菌菌株都含有一个或多个上述限制系统(7-12)。需要甲基化的限制系统具有序列特异性；McrA、McrBC和Mrr不会限制Dcm位点甲基化的DNA，Mrr也不会限制Dam、EcoKI或EcoRI位点修饰的DNA。除了限制M.SssI修饰的DNA，McrA还会限制HpaII甲基化酶(5′CmeCGG)修饰的DNA(2)，而McrBC会限制含5′RmeC序列的DNA(2,3,13)。McrA和McrBC不区分5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶；McrBC还会限制在适当序列中包含N4-甲基胞嘧啶的DNA(3)。Mrr限制多种腺嘌呤甲基转移酶以及几种5-甲基胞嘧啶甲基转移酶修饰的DNA，但还没有推导出共有顺序(4，6)。几乎所有实验室的E．coli 菌株都是野生分离株K-12或B的衍生物，不携带有些野生分离株含有的EcoRI或其它II型限制系统。注意：已证实，克隆实验中mcr和mrr位点可减少哺乳动物(8,9,11,14)和植物(9,15)甲基化序列的回收量。一般说来，从含有甲胞嘧啶有机体中克隆基因组DNA时，明智之举是使用无Mcr 和Mrr系统的菌种[如NEB 10-beta 感受态细胞(NEB #C3019)、NEB表达感受态细胞(NEB #C2523)或者T7 表达感受态细胞(NEB #C2566)]。这些有机体包括所有哺乳动物和高等植物，以及许多原核生物(16)，但是不包括重要的实验有机体果蝇(17)和酿酒酵母(18)。此外，此类菌种还应在胞嘧啶甲基转移酶造就新物种(19)或者保护cDNA免受酶切消化(20)过程中使用。由于甲基化腺嘌呤在许多细菌和低等真核细胞中存在，因此，从这些有机体中克隆基因组DNA时也应考虑到Mrr介导限制。以下情况无须考虑E. coli K-12的限制：大肠杆菌克隆复制后，外源甲基化模式将会丢失(获得大肠杆菌的甲基化模式)，除非克隆载体本身具有甲基转移酶活性。一旦成功导入，克隆可在Mcr+ Mrr+大肠杆菌菌株间自由转移，因为此时的甲基化模式已经不再为外源性。将DNA导入K-限制菌株[如NEB5-alpha感受态细胞(NEB #C2987)、NEB 5-alpha F´Iq 感受态细胞 (NEB #C2992)或者NEB Turbo 感受态细胞 (NEB #C2984)]之前须肯定DNA为K-修饰模式。

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