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DNA实验

基因合成实验

2024-06-08 DNA实验 加入收藏
原理基因合成是指在体外人工合成双链DNA分子的技术,与寡核苷酸合成有所不同:寡核苷酸是单链的,所能合成的最长片段仅为100nt左右,而基因合成则为双链DNA分子


原理

基因合成是指在体外人工合成双链DNA分子的技术,与寡核苷酸合成有所不同:寡核苷酸是单链的,所能合成的最长片段仅为100nt左右,而基因合成则为双链DNA分子合成,所能合成的长度范围50bp-12 kb。基因合成是用人工方法合成基因的技术,是基因获取的手段之一,相对于从已有生物中获取基因来说,基因合成无需模板,因而不受基因来源限制。

材料与仪器

DNA
dNTP DAN聚合酶 乙醇 TE 限制性内切核酸酶缓冲液
水浴锅 培养箱

步骤

1. 将两种寡核苷酸各1 μg加入微量离心管中,加水至17 μl,再加2 μl 的10×测序酶缓冲液。70℃加热5 min,然后在合适的退火温度下保温5 min,取2 μl 留待以后的分析。


2. 加2μl 4种dNTP混合液和10U测序酶,30℃温育30min。


3. 70℃ 10min 灭活DNA聚合酶,取2 μl 留待以后的分析。


4. 加10×限制性内切酶反应缓冲液,加水和20——100 U 的适合于克隆的限制性内切酶至100 μl。适当的温度下消化2 h以上。


5.  酚抽提,加100 μl 4 mol/l 乙酸铵和400 μl的无水乙醇,-70℃沉淀15 min,离心5 min,沉淀重悬于100 μl TE缓冲液,用乙醇再沉淀一次,用95%乙醇洗涤沉淀,干燥,20 μl TE缓冲液溶解,取2 μl用于以后的分析。


6. 用筛分型琼脂糖凝胶电泳分析确证原材料、延伸产物和酶切产物,估计延伸的寡核苷酸的量,再用适当的载体亚克隆。


7. 对几个合适的亚克隆测序。


注意事项

1. 反应液的配制、分装请一定使用新的(无污染)枪头、Microtube等,尽量避免污染。


2. 配制反应体系时,应注意移液器的使用方法,所有的液体都要缓慢加至管底,不要加至管壁,所有液体的混匀都要用振荡器进行,避免产生气泡。



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