补体介导的细胞毒试验

1、实验原理

带有特异抗原的靶细胞（如正常细胞、肿瘤细胞、病毒感染细胞）与相应抗体结合后，在补体的参与下，引起靶细胞膜损伤，导致细胞膜的通透性增加、细胞死亡。染料（例如：伊红-Y、台盼蓝）可通过细胞膜进入细胞内使细胞着色，故可用于指示死细胞或濒死细胞，而活细胞不着色。此即补体依赖性细胞毒试验，利用细胞毒试验可以检查细胞膜抗原，亦可鉴定抗体的特异性。

本实验中，Thy-1抗原是小鼠胸腺T细胞特异的表面抗原，在体外利用抗小鼠Thy-1的单克隆抗体通过补体的协同作用，可杀伤95％以上的胸腺细胞。

2、实验材料

（1）解剖器械(眼科剪、眼科镊)、平皿、80～100目不锈钢网；

（2）试管、lml吸量管、尖吸管；

（3）载玻片、盖玻片；

（4）C57BL／6J小鼠；

（5）含5％NBS的冷Hank’s液；

（6）抗小鼠Thy-1的单克隆抗体（最适稀释度，本室制备）；

（7）补体(豚鼠新鲜血清并经小鼠胸腺细胞吸收，预先测定效价并稀释为最佳稀释度)；

（8）1%伊红-Y染液。

3、实验方法

（1）小鼠胸腺细胞悬液的制备：将4～6周龄小鼠采用颈椎脱臼法处死，取出胸腺放入已加入约4ml冷Hank’s液的平皿中，在100目的不锈钢网上研磨后，过筛，放入试管，离心1000rpm，5分钟，用Hank’s液洗两次。将沉淀的细胞重悬于Hank’s液中，配成1×107／ml细胞悬液。

（2）取试管3支，标明顺序，依据下表依次加入1×107/ml胸腺细胞悬液、抗小鼠Thy-1的单克隆抗体(最适稀释度)及Hank’s液，放入37℃水浴30分钟。

（3）取出后每管加入1%伊红-Y染液1滴，混匀，室温放置2分钟。

（4）重新混匀后分别在一张载玻片上滴片，加盖玻片镜检。先在低倍镜下观察，再用高倍镜观察，比较3管中细胞死活情况。

4、实验结果

死细胞呈红色，无光泽且肿胀变大；活细胞不着色、有光泽且形态正常。

高倍镜下计数200个细胞并计算其中死细胞的百分数。计算公式如下：死细胞百分数= EQ EQ \F(实验管死细胞数%-对照管死细胞数%,100%-对照管死细胞数%)

5、注意事项

（1）胸腺细胞制备速度要快，且需在冰浴中进行操作，以保持细胞活力；

（2）抗Thy-1的单克隆抗体和补体的效价要在预实验中确定；

（3）细胞对照管死细胞数若超过5%，实验需重新做；

（4）细胞滴加到载玻片上后长时间放置不检测也可导致假阳性反应。