交叉保护中和实验
试验目的 血清分型
标本 出血热恢复期病人血清
材料
1、 毒株 汉滩病毒标准株 76－118，汉城病毒标准株 Seoul；
2、标准血清 兔抗汉滩病毒、汉城病毒血清；
3、空斑减少中和试验常用试剂。
步骤
1、将待检血清用牛血清Hanks 氏液稀释成1：10，56℃灭活30分钟；
2、进一步2倍稀释血清成1：20、1：40、1：80……，对照血清1：10稀释；
3、稀释两种病毒（在冰浴中进行）至含200pfu/ml；
4、各连续稀释度血清分别与200pfu/ml的两种病毒液等量混合（各0.3ml），置37℃中作用1小时（每15分钟振荡一次）；
5、吸出各细胞培养孔中维持液；
6、接种长满单层的Vero-E6细胞（24孔板），每孔接种血清病毒混合液、标准血清对照及两种病毒对照 ，每稀释度两孔，100ul/孔。37℃吸附1小时，每隔15分钟摇动一次；
7、加第一层琼脂糖覆盖液（需冷置42℃左右），每孔1ml，室温下待凝固，细胞面朝上，置37℃5%CO2孵箱培养7-9天；
8、加第二层含中性红琼脂糖覆盖液，1ml/孔，室温下待凝固，细胞面朝上，置37℃5%CO2孵箱培养2-5天，从第二天开始观察空斑数；
9、抗体滴度的判定，以比病毒对照的空斑数中和或减少50%的血清最高稀释度倒数判为待检血清中和抗体滴度；
10、型别判定：根据同一份血清与两种病毒的反应滴度不同来区分，如果一份血清与汉滩病毒 （或汉城病毒）反应的抗体滴度高于与汉城病毒（汉滩病毒）的抗体滴度4倍或以上，即判为汉滩病毒型，反之则为汉城病毒型。两者滴度相差无几时，则不好分型。不足4倍时亦不能定型。
配方
1、第一层琼脂糖覆盖液
| 2×Eagle MEM液 | 50ml（Gibco-BRL） |
| 灭活胎牛血清 | 10ml |
| L-谷氨酰胺 | 4ml（200mmol/L,100X） |
| MEM非必需氨基酸 | 1ml（Gibco,100x） |
| 1mol/L HEPES缓冲液 | 2ml |
| 青链霉素 | 1ml（青霉素10000u/ml,链霉素10000ug/ml） |
| 制霉菌素（一般可以不加） | 0.1ml |
| 临用前配制，放入42℃水浴中，另取 | |
| 琼脂糖 | 0.6g（Sigma, Type II medium EEO） |
| 超纯水 | 34ml（适用于细胞培养的纯化水） |
| 8磅高压灭菌15min，置42℃水浴15min，加入上述配制的组分中，即可使用。 | |
2、第二层琼脂糖覆盖液 基本上同第一层琼脂糖覆盖液，仅将灭活胎牛血清改为5ml，另加中性红溶液1ml（333.0ug/L中性红钠盐Gibco）。
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