盘选(Panning)分离法分离T细胞亚群

聚苯乙烯表面可以用作亲和性试剂的不溶性基质，以分离淋巴细胞亚群。聚苯乙烯培养皿首先用纯化的羊抗鼠IgG抗体包被，然后将鼠抗人(如抗CD4或抗CD8单抗)与T细胞反应的细胞悬液加入培养皿中，孵育一段时间后，对CD4或CD8抗原特异的T细胞即结合到平皿表面，而CD8+或CD4+细胞不结合，轻吸出未贴壁的细胞悬液，洗下粘附细胞。

      [试剂及配制]       (1)聚蔗糖-泛影葡胺分层液(D=1.077±0.001)       (2)抗CD4和抗CD8单克隆抗体       (3)羊抗鼠IgG 抗体       (4)Hank’s液(含5%小牛血清、不含Ca2+、Mg2+)       (5)pH 9.0, 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液       (6)pH 7.5, 0.15mol/L PBS(含10%小牛血清)       (7)pH 7.2, 0.15mol/L PBS       (8)盐酸利多卡因(20mg/ml)         [操作方法]         (1)羊抗鼠IgG抗体包被聚苯乙烯平皿       ①用pH 9.0, 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液配制成10mg/ml羊抗鼠IgG抗体溶液；       ②吸取适量抗体溶液于培养皿中，室温孵育1.5h或4℃ 18h；       ③用5ml左右的pH 7.5，0.15mol/L PBS洗涤培养皿3次，去除未结合的抗体；       ④加5ml的 pH 7.2，0.15mol/L PBS(含10%小牛血清)于培养皿中，室温孵育15min；       ⑤用pH 7.2, 0.15mol/L PBS洗培养皿3次，4℃过夜，或放入-20℃备用。保存时间不得超过2～3个月。         (2)阴性选择法(CD8+细胞的富集)       ①取肝素抗凝外周血，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液法分离单个核细胞，E玫瑰花环技术分离T细胞，用Hank’s液将T细胞沉淀配成3～4×106 /ml；       ②取T细胞悬液与适量的抗CD4单克隆抗体反应，4℃反应30min；       ③用Hank液洗细胞2次，每次1000r/min离心10min，去除未结合的单克隆抗体；       ④取3ml细胞悬液加入到羊抗鼠IgG 抗体包被的培养皿中，室温反应1h。注意间隔10～15min轻摇一次；       ⑤用5ml Hank’s液轻轻洗脱下未粘附细胞，一般4次，收集的细胞(即为CD8+细胞)4℃存放。注意：避免用吸管直接触动平皿。         (3)阳性选择法分离粘着细胞(CD4+细胞的富集)       ①用Hank’s液配制盐酸利多卡因，最终浓度为4mg/ml；       ②加3～4ml利多卡因溶液到洗过的培养皿中，室温下静置10～15min，尖吸管吹打细胞，直到粘附的细胞全部剥脱为止；       ③用Hank’s液洗平皿，离心细胞，1000r/min,10min,细胞沉淀再用Hank液洗3次，获得CD4+细胞。         同样的方法，如果T细胞悬液与CD8单抗反应，阴性选择法获得CD4+细胞，阳性选择法获得CD8+细胞。         (4)将获得的CD4+和CD8+细胞4℃保存备用，并检测细胞的纯度和活力。         [结果分析]       该法分离的细胞活力大于98%，用直接或间接免疫荧光法检测分离的细胞纯度。       阳性选择法       CD4+细胞 范围89%～100%       CD8+细胞 范围85%～100%       阴性选择法       CD4+细胞 范围78%～94%       CD8+细胞 范围77%～88%         [注意事项]         (1)     此技术需有足够的单克隆抗体吸附于塑料表面上，且除去的细胞不会自发地粘附于培养皿上。       (2)     根据培养皿底的面积适当地调节细胞悬液的体积。       (3)     本试验可以用无菌的培养瓶代替平皿，因为蛋白质包被的培养瓶比培养皿更易于储存。       (4)     为了把粘附到固体基质上而导致的非特异性结合减少到最小程度，需用无Ca2+ 、Mg2+ 培养液。       (5)     每次制备的鼠抗人T细胞单克隆抗体并不一致，所以每次制备后均需经过预实验确定抗体的稀释倍数。