植物组织中游离氨基酸总量的测定

氨基酸 (amino acid) 是组成蛋白质的基本单位，也是蛋白质的分解产物。植物根 系吸收和同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式进行运输。所以测定植物组织中不同时期、 不同部位游离氨基酸的含量，对于研究根系生理、氮素代谢等有一定意义。本实验的目的是 掌握站三酮显色法测定氨基酸含量的原理和方法。

原理

植物组织中游离氨基酸总量的测定的基本原理是氨基酸的游离氨基与水合站三酮反应 (如下)。首先，氨基酸脱氨脱殁被氧化，水 合帯三酮被还原成还原型站三酮。接着，还原型弗三酮与另一个氧化型带三酮分子和氨缩合 生成蓝紫色化合物，称为 Ruhemans 紫。其吸收峰为 570 nm, 且在一定范围内，其颜色深浅 与氨基酸的含量成正比。据此，可用分光光度计在波长 570 nm 下测定反应产物的吸光度值, 根据标准曲线计算岀未知样品中氨基酸的总量。脯氨酸与站三酮反应生成黄色物质，需另行测定。

材料与仪器

材料：各种植物组织。

器材：分光光度计，恒温水浴，天平，容量瓶，漏斗，三角瓶，研钵，具塞刻度试管，移液 管等。

试剂：

(1) 水合站三酮试剂：称取 0.6 g 再结晶的茹三酮置于烧杯中，加入 15 mL 正丙醇，搅拌 使其溶解。再加入 30 mL 正丁醇及 60 mL 乙二醇，最后加入 9 mL pH 5.4 的乙酸-乙酸钠缓 冲液，混匀，贮于棕色瓶中，置冰箱中保存备用，10 天内有效。

(2)pH 5. 4 乙酸-乙酸钠缓冲液：称取结晶乙酸钠 54. 4 g, 加 100 mL 无氨蒸馅水，在电炉 上加热至沸，使体积蒸发至原体积的一半。冷却后加 30 mL 冰乙酸，用无氨蒸循水定容至 100 mL。

(3) 标准氨基酸溶液：称取 80C 下烘干的亮氨酸 46.8 mg, 溶于少量 10% 异丙醇中，用 10% 异丙醇定容至 100 mL。取此液 5 mL, 用无氨蒸個水稀释至 50 mL, 即为含氮 5 昭- mL1 的标准氨基酸溶液。

(4)0. 1% 抗坏血酸：称取 50 mg 抗坏血酸溶于无氨蒸馅水中，并定容至 50 mL, 随用 随配。

(5)10% 乙酸：用无氨蒸馅水配制，按 V/V 计。

步骤

植物组织中游离氨基酸总量的测定的基本过程可分为如下几步：

1. 标准曲线制作：取 6 支 20 mL 具塞刻度试管，编号，按表 51-1 添加试剂。混匀，盖上玻 塞，置沸水浴中加热 15 min, 然后取出放在冷水浴中迅速冷却并经常摇动，使加热时形成的红 色逐渐被空气氧化而褪色，直至溶液呈蓝紫色时，加 5 mL 无氨蒸馅水，混匀，用光径 1 cm 的 比色杯，在波长 570 nm 下测定其吸光度值。以氨基态氮量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘 制标准曲线。

表 51-1 标准曲线制作加样表

2. 样品提取: 取新鲜植物样品，洗净、擦干并剪碎、混匀后，迅速称取 0.5〜1.0 g, 于研钵 中加入 5 mL 10% 乙酸，研磨成匀浆后，用无氨蒸馅水定容至 100 mL, 摇匀，上清液用干滤纸 过滤到三角瓶中备用。

3 . 样品测定：吸取上清液 1 mL, 放入 20 mL 具塞刻度试管中，加无氨蒸馅水 1 mL, 其他 步骤与制作标准曲线操作相同，测定样品液的吸光度值，根据吸光度值在标准曲线上查得样 品液的含氮量。

4. 结果计算:

C X V

游离氨基酸含量 (mg・100 g-】FW) = w x ] 00()X100

式中：C 一为从标准曲线上查得的含氮量屮 g；

V 一样品液总体积»mL；

W■-样品重»go

注意事项

1. 合格的站三酮应该是微黄色结晶，若保管不当，则颜色加深或变成微红色，必须重结晶 后方可使用。其方法如下：5 g 站三酮溶于 15 mL 热蒸馅水中，加入 0.25 g 活性炭，轻轻摇 动，溶液太稠时，可适量加水，30 min 后用滤纸过滤，滤液置冰箱中过夜后即可见微黄色结晶 析出，用干滤纸过滤，再用 1 mL 蒸馋水洗结晶一次，置于干燥器中干燥后贮于棕色瓶中。

2. 氨基酸与站三酮反应十分灵敏，需用无氨蒸憎水。

3. 所生成的颜色在 1 h 内保持稳定，稀释后应抓紧时间比色，用水稀释反应生成物时，须 在 0.5 h 内测完。

4. 由于空气中氧干扰颜色反应，以抗坏血酸为还原剂，可提高反应的灵敏度并使颜色稳 定, 但由于抗坏血酸也可与茄三酮反应，使溶液显色过深, 故应严格掌握加入抗坏血酸的量。

5. 反应时的温度影响显色的稳定性，在沸水浴中加热温度超过 80°C, 溶液易褪色。在 80°C 水浴中加热，适当延长反应时间会获得良好的效果。