过氧化氢含量的测定
简介
很多生物和非生物逆境都会诱导过氧化氢 (H2O2) 的产生，日。2 作为信号分子 在植物抗逆过程中起重要作用。因此，对 h2o2 在植物体内变化的了解，可反映出植物体对 逆境胁迫的响应程度。通过本实验可了解 h2o2 含量测定的原理和方法。
原理
过氧化氢含量的测定的基本原理是H2O2与硫酸钛 (或氯化钛) 生成过氧化物-钛复合物黄色沉淀，可被 H2SO4 溶解后，在 415 nm 波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与 H2O2 浓度呈线性关系。
材料与仪器
材料：分别取幼嫩和衰老的植物叶片或其他受逆境胁迫的植物组织。
器材：研钵,0.2 mL 移液管 2 支，5 mL 移液管 1 支，10 mL 容量瓶 7 个,5 mL 离心管 8 支，离心机, 分光光度计。
试剂：
①100 μmol・H2O2 溶液：取 30% 分析纯 H2O2 57 μL, 溶于 100 mL, 再稀释 100 倍
②2 mol ・ L-l 硫酸溶液
③5%(W/V) 硫酸钛溶液
④丙酮
⑤浓氨水
步骤
过氧化氢含量的测定的基本过程可分为如下几步：
1. 标准曲线的制作：取 10 mL 离心管 7 支，顺序编号, 并按表 47-1 加入试剂。
表 47-1 玮。2 浓度标准曲线制作加样表 mL
试剂 | 离心管号 | ||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |
100 〃mol ・ L_1 H2O2 溶液 | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
4°C 下预冷丙酮 | 1.0 | 0.9 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
5% 硫酸钛溶液 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
浓氨水 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
3 000 rmin-1 离心 10 min, 弃去上清液，留沉淀 | |||||||
2 mol - Li 硫酸溶液 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
待沉淀完全溶解后，将其小心转入 10 mL 容量瓶中，并用蒸馅水少量多次冲洗离心管，将 洗涤液合并后定容至 10 mL 刻度，在 415 nm 波长下比色。
2. 样品提取和测定：
（1） 称取新鲜植物组织 2〜5 g（视 H2O2 含量多少而定），按材料与提取剂 1 ： 1 的比例加 入 4°C 下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管 3 000 r • min-1 下离心 10 min, 弃去残渣，上清液即为样品提取液。
（2） 用移液管吸取样品提取液 1 mL, 按表 47-1 加入 5% 硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后 3 000 r • min"1 离心 10 min, 弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤 3〜5 次，直到去除植物 色素。
（3） 向洗涤后的沉淀中加入 2 mol - L'1 硫酸溶液 5 mL, 待完全溶解后，与标准曲线同样 的方法定容并比色。
3 . 结果计算：
植物组织中 H2O2 含量（卩 mol・g7FW）=^£3
式中：〃一标准曲线上查得样品中 H,O2 的物质的量，卩 mol；
K-样品提取液总体积，mL；
V1 —测定时用样品提取液体积，mL；
W 一植物组织鲜重・g。
注意事项
H2O2 溶液在放置过程中会自行分解，因此久置的H2O2溶液临用前要经过重新标定。
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