同源一步荧光等位基因特异性PCR

同源一步荧光等位基因特异性 PCR，是利用含有大量吸收单元的水溶性共轭聚电解质（water-soluble conjugated polyelectrolytes，CP），激发能量沿着 CP 的骨架转移到发色团报告物，导致荧光信 号的扩增。将等位基因特异性 PCR 与利用 CP 检测联合起来。

同源一步荧光等位基因特异性 PCR 的基本原理同等位基因特异性 PCR 一样，同样需要三条引物，分别针对不同等位基因的两条上游引物、一条共同的下游引物，不同之处在于检测方法。在图 14-6 中，阳离子多聚物 PFP［9，9-bis（6-N，N，N-trimethylammoni-um）hexyl fluorenylene-phenylene dibromide］在荧光共振能量转移检测系统（fluorescence res-onance energy transfer，FRET）实验中用作共跑聚电解质，荧光素标记的 dGTP 和 dUTP 作为受者，PFP 作为荧光素的供者，以满足对于 FRET 的要求。含有 G 等位基因的靶 DNA 序列作为模板，在图 14-6 的情况 A 中上游引物 3' 含有与 G 配对的 C，引物与模板配对很好，PCR 反应正常进行。

在 Taq DNA 聚合酶存在下，链延伸时 dGTP-F1 和 dUTP-Fl 掺入到 DNA 链中。经过指数扩增后，得到大量的荧光素标记的扩增产物。一旦加上含有阳离子的 PFP，DNA 与 PFP 之间的强静电相互作用使得荧光素靠近 PFP，PFP 与荧光素发生了有效的 FRET。在情况 B 中，上游引物的 3' 端是与等位基因 C 配对的，与等位基因 G 并不互补，在热循环过程中，只有反向引物延伸引起的线性扩增，产生较弱的荧光素标记的 PCR 产物，在加入 PFP 之后，发生无效的 FRET。通过引发 PFP 和荧光素的发射密度的变化，就可能分析 SNP 的基因型。

器材：PCR 扩增仪、荧光分光光度计（Hitachi F-4500）。

试剂：

① 模板：基因组 DNA；

② dNTP 混合液：每种脱氧核糖核昔酸的浓度为 2.5 mmol/L；

③ 三条特异引物：浓度均为 10 μmol/L；

④ Tag DNA 聚合酶及 10 × PCR 缓冲液：15 mmol/L MgCl2，500 mmol/L KCI，100 mmol/L Tris-Cl，0.1%（体积分数）Triton X-100；

⑤ 虾碱性磷酸酶（Shrimp alkaline phosphatase，Takara）；

⑥ dGTP-Fl（Perkin Eime），dUTP~Fl（Fermentas），PFP，SYBR gold（Invitrogen）；

⑦ 高压灭菌去离子水；

⑧ 用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的电泳仪（DYCZ-24D，北京六一）及相关试剂。

同源一步荧光等位基因特异性 PCR 的基本过程可分为如下几步：

1. 模板

利用试剂盒提取的基因组 DNA。

2. 引物设计

引物设计方法见等位基因特异性 PCR。

3. 操作方法

(1) 设立 20 μl 的 PCR 反应体系至少配制两管反应液，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入以下成分。

（2）设置 PCR 反应条件

（3）PCR 产物的检测：将 PCR 扩增产物在 15% 的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，缓冲液为 1 × TBE, 电泳之后，用溶于 1 × TBE 缓冲液的 1 × SYBR Gold 染色 30 min 后，观察照相。

在荧光检测中，向 PCR 产物中加入 4 μl 虾碱性磷酸酶（0.5 U/μl），于 37 ℃ 孵育 20 min 以降解未反应的 dNTP-Fl。孵育之后，混合物置于 4 ℃，用 HEPES 缓冲液（25 mmol/L，pH8.0）稀释此混合物后，加入 PFP，使用 3 ml 石英小杯在激发波长为 380 nm 处检测发射光谱，狭缝宽度和 PMT 电压分别是 5 nm 和 700 V。

① PCR 反应的相关注意事项见等位基因特异性 PCR，二者的操作原理一样，因此注意事项也相同。

② 在荧光检测部分，选择合适的 PFP 是至关重要的，不同的 PFP 激发的荧光强度不同，需 要进行预实验摸索条件。