噬菌体展示抗体库构建目的基因的获得PCR引物的设计

利用PCR技术扩增抗体VH和VL基因，所获得的产物需要满足以下两个要求：首先，得到的产物必需是正确的目的基因，要有可靠性；其次，要获得尽可能多种类目的基因，即有多样性。因此，设计出合理的扩增引物十分重要。 哺乳动物功能性抗体基因是由种系基因在DNA水平上重排产生的。以小鼠的抗体重链为例，VH基因由V、D、J三部分构成。在小鼠第12号染色体上，大约有300种V基因、12种D基因、4种J基因，在B细胞发育过程中，发生基因重排，由其中一个V、D、J共同组成一个VH，这样在一个动物个体中可能的VH至少有15，000种。 如果考虑到重排过程中在D区和J区连接处产生的多种变化，这一数字是大大地保守了。小鼠的VL基因是通过V-J重排产生的，估计其多样性至少有2，000种。 当前PCR引物设计所依据的数据主要来自已发表的抗体可变区基因序列文献，包括Kabat等人编写的《SequenceofProteinsofImmunologicalInterests》（1991），EMBLDatabase，GenbankDatabase。由于抗体基因编码FR区的部分比编码CDR区的部分要保守，因此可以将引物设计为FR区的互补序列。 针对抗体不同亚族其FR区序列也不尽相同的特点，本室设计了一组引物以确保不会漏掉某一亚族。选择与FR1区段互补的序列作为5’端引物，选择与FR4互补的序列作为3’端引物。扩增的产物是VH或VL基因。为了便于基因克隆，还在引物外侧加上了合适的酶切位点，重链是XhoI-SpeI，轻链是XbaI-EcoRI。 这些酶所识别的序列经计算机检索，证明很少或几乎不在抗体可变区基因内出现。在酶切位点外侧有至少两个保护碱基，通常是CC或GG，以便提高内切酶的切割效率。保护碱基越多，越利于提高限制酶切的效率，但是成本也会提高。

（1）引物长度一般介于17~35碱基之间，一般以20~28个碱基为宜，这不包括额外的内切酶识别序列和外侧的保护碱基。

（2）四种碱基在引物内的分布应尽量随机，GC含量应为大约50％。

（3）避免引物内出现多聚嘌呤或多聚嘧啶。

（4）检查5’与3’引物之间或内部是否有相互配对的情况。

（5）避免使用有明显二级结构的序列，尤其是在引物3’端。

（6）在引物5’端允许少量与模板不配对的碱基存在，但在3’端的序列应与模板互补。

（7）防止引物中出现一切可能影响正常转录和翻译过程的序列。 目前国内外已开发出多种PCR引物设计软件，使引物设计更加方便、快速、准确、合理。引物设计完成后即可用DNA合成仪合成，引物使用前用OPC柱、HPLC或PAGE纯化。 利用所设计的引物，已成功地从多种杂交瘤中扩增出特异的抗体可变区基因，充分表明这套引物是成功、合理的。