rep－PCR

rep－PCR 的应用范围限于含有 REP、BOX 和 ERIC 序列（或相似序列）的细菌，但有些缺乏这些序列的菌种中会包含类似的重复性序列，就像不同的 DNA 序列信息存在于不同的微生物系统一样，新的重复性序列将会被发现，而且从整个生物界的角度来看在自然选择压力下，必然导致在几乎所有生物中都存在保守和重复序列，因此 rep－PCR 作为一种技术思路对微观和宏观的生物研究都有启发。

rep－PCR 基因组指纹图谱分析常用的三组引物分别指的是 REP、ERIC 和 BOX 序列，基于它们的 PCR 方法分别称为 REP－PCR、ERIC－PCR 和 BOX－PCR，总称为 rep－PCR。这些引物可以扩增两个重复序列之间的 DNA，每个样品的基因组都会产生一个包括 10~30 个甚至更多 PCR 片段的复杂带型，而它们的分布从不到 200 bp 到大于 6 kb 不等。

进行 rep－PCR 的主要步骤包括：

①细菌基因组的提取和定量；

②寡核昔酸引物的设计与合成；

③以基因组 DNA 为模板进行 PCR 反应，将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到指纹图谱带型；

④对 PCR 产物带型进行计算机分析。

rep－PCR 的基本原理：

REP－PCR，ERIC－PCR 和 BOX－PCR 的基本原理就是先在所试样品中提取基因组 DNA， 基于 REP、ERIC 和 BOX 序列设计出特定引物，以含有这些序列的细菌基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增，PCR 产物可以通过琼脂糖凝胶电泳得到清晰可辨的带型，每条带型都代表了基因组中任意两个重复序列间 DNA 的扩增片段，由于不同菌株的基因组中两个重复序列间的距离是不同的，所产生的 PCR 带型大小也不尽相同，形成了被测菌基因组特异的指纹图谱，从而可以鉴别出不同菌种和同一菌种的不同菌株。

rep－PCR 可用于临床致病菌株的快速鉴定，细菌的分型，分子层面上的细菌亲缘关系的确定等方面。

器材：PCR 仪、琼脂糖电泳仪、数码成像系统和计算机分析系统

试剂：

① 基因组 DNA

② 分光荧光测定仪 （用于基因组定量）

③ TE 缓冲液 （10 mmol/L Tris－HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）

④ 热稳定 DNA 聚合酶及其 10× 缓冲液

⑤ REP 系列和 ERIC 系列寡核苷酸引物

⑥ 10 mmol/L dNTP

⑦ 酚－氯仿 （1:1，体积比）

⑧ 氯仿

⑨ 乙酸钠 （3mol/L，pH 5.2）

⑩ 乙醇 （100％ 和 70％）

rep－PCR 的基本过程可分为如下几步：

（一）流程一

基因组 DNA 的抽提：

对于革兰阴性菌/螺旋体和革兰阳性菌的基因组 DNA 分别采用了不同的抽提方法。

A. 革氏阴性菌/螺旋体：

将细胞置于小离心管中，以固定的角度 15000 r/min 离心 5 min， 用 1 ml 1 mol/L NaCl 洗两次，重悬细胞于 TE 溶液中，然后在 0.2 mg/ml 的裂解酶和 0.3 mg/ml 的 RNaseA 中，37 °C 培育 20 min。如果裂解酶的裂解效果不明显，在悬浮液中加入 0.6％ SDS， 再加入 1％ 的肌氨酰和 0.6 mg/ml 的蛋白酶 K，然后将细胞在 37 °C 培育 1 h。细胞裂解物用酚抽提两次，再用氯仿抽提两次，水相用 0.33 mol/L 的醋酸铵和 2.5 倍体积的乙醇进行沉淀。将沉淀下来的 DNA 溶于 TE 中。

B. 革兰阳性菌：

将细胞置于小离心管中离心 5 min，将细胞沉淀重悬于 TE 溶液中，然后在 250 U/ml 的变溶菌素和 0.3 mg/ml RNaseA 中 37 °C 培养 30 min，然后在该反应液中加入 0.6％ 的 SDS 和 0.6 mg/ml 的蛋白酶 K，混合物先在 37 °C 培育 1 h，再在 65 °C 培育 45 min，裂解液用酚抽提两次，再用氯仿抽提两次，细菌染色体的沉淀与溶解与前述步骤一致。

（二）流程二

基因组 DNA 的定量：

A. 基因组 DNA 用分光荧光测定仪进行定量，激发波长和散射波长分别是 365 nm 和 460 nm， 根据所用仪器说明对 DNA 进行染色和用荧光计标定。

（三）流程三

引物的设计与合成：

REP 序列形成茎环结构，其茎部序列十分保守。REP 的共有序列如下：

G G C G C C

5'－GCC GATGNCG CG NNNNN CG CTTATC GGCCTAC－3'

T A T A T A

简并后的 38 bp 的 REPALL 寡核昔酸序列包括了所有 REP 的一致序列，因为简并性的需要，特殊位点的核苷酸为四种碱基 AGCT 或肌苷 I 所代替。肌苷 I 可以和 AGCT 形成 Watson－Crick 螺旋，其参与形成的氢键要弱于 A:T，但所形成的碱基对是最稳定和最少错配的。简并后的 REP 共有序列如下：

REPALL－I 5'－GCCIGATGICGICGIIIIIIICGICTTATCIGGCCTAC－3'

G G C G C C

REPALL－D 5＇－GCC GATGICG CG IIIII CG CTTATC GGCCTAC－3'

T A T A T AREP

引物的设计包括了两边对称的茎部序列，但方向是相反的，因为茎部序列的一侧要短于另一侧，在引物 REP1R 的 5』端添加了三个肌苷，这样引物 REP1R 的长度就与引物 REP2 的 18 bp 的长度相一致了。

REP1R 5' IIIICGICGICATC IGGC3'

REP2 5' lCGICTTATCIG GCCTAC3'

ERIC 的共有序列为：

5＇ GTGAATCCCCAGGAGCTTACATAAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG 3＇

ERICALL 寡核昔酸序列包含了整个保守的重复倒装序列的中心核，并不存在简并性。扩增引物 ERIC1R 和 ERIC2 分别由对称的倒转重复中心而来，方向相反。

ERIC1R 5' ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC 3'

ERIC2 5' AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG 3'

BOX 序列常用的为 BOX A1R 引物，利用它或者联合 REP 序列可以扩增出基因组指纹图谱。

BOX AIR 5' CTACGGCAAGGCGACGCTGACG 3'

（四）流程四

PCR 反应体系：

① 上游引物：0.5 umol/L

② 下游引物：50 umol/L

③ 基因组 DNA 模板 100 ng

④ dNTP:1.25 mmol/L

⑤ 2 U Tag DNA 聚合酶

⑥ 10× Tag DNA 聚合酶反应缓冲液 10 ul（加入 10％ DMSO，体积分数）

⑦ 加入蒸馏水使整个反应体积为 100 ul

（五）流程五

PCR 反应条件：

95 °C 预变性 7 min；90 °C 变性 30 s， 退火 （REP，40 °C，1 min； ERIC，52 °C，1 min；BOX，50 °C，1 min），65 °C 延伸 8 min，共做 30 个循环。最后，65 °C 延伸 10 min。

注意事项：

受聚合酶扩增长度的限制，运用 rep－PCR 只能检测到两个相邻重复序列间 ＜ 5 kb 的片段，对于间隔较大的重复序列的分布情况无法用这种方法检测到，为此，常结合狭缝印迹 (slot blot) 杂交方法考察重复保守序列在基因组中的分布状况。狭缝印迹杂交将 rep－PCR 的引物作为杂交探 针与基因组 DNA 作用，此种方法不受两个相邻重复序列的距离和方向的限制。

操作步骤如下：

a. 将探针 5』末端进行标记，在 50 pmol REP 或 ERIC 引物中加入 20 U T4 多核昔酸激酶，50 ul ［γ－32P］ ATP （6000 Ci/mmol）。

b. 将未标记的同位素洗脱，把 50 ul 的反应液溶入 1 ml 去离子无菌水中，然后置于 Centricon－3 管中离心，游离的放射性同位素就被管中的滤膜滤掉了，所留下的溶液中含有被标记的寡核昔酸探针。

c. 杂交膜的准备，在杂交膜的狭槽中加入 10 ng 的变性基因组 DNA。基因组 DNA 在 100 °C 变性 5 min， 然后将其转移到膜上，并在每个槽中加入 500 ul 0.4 mol/L NaOH。将膜用 1×SSC 冲洗，再用吸水纸吸干。将此膜在 80 °C 烘干 1 h， 置于密闭塑料袋中，- 20 ℃ 保存。

d. 杂交方法。

REP 探针的杂交：将杂交膜于 42 °C 预杂交 1.5 h。将探针于 100 ℃ 变性 5 min， 然后加入到杂交液中，使放射性强度达到 1×106 cpm/ml。然后将膜在 42 °C 温育 15 h。

ERIC 探针的杂交：基本与 REP 相同，但预杂交与杂交都在 65 °C 进行。

e. 洗膜。在室温将杂交膜用 ×SSPE 和 0.1％ SDS 洗两遍，最后一遍洗的时候 REP 37 °C，15 min；ERIC 40 ℃，1 min。

f. 放射自显影。于带有两个增感屏的胶卷上 85 °C 曝光 24 h。

（六）流程六

PCR 结果的分析：

取 5~10 ul PCR 反应液，在包含 1×TAE，0.5 ug/ml 溴酚蓝和 1％ 琼脂糖的凝胶中进行电泳。以 1 kb 标定 Marker 作比较，得到该基因组特异的指纹图谱。

注意事项：

假阳性结果的产生。

假阳性结果产生的原因有如下可能：非特异带的扩增，来自细胞、培养环境或气体中悬浮颗粒的外源 DNA 污染，或者来自前面实验样品的 DNA 的痕量污染。因此，在进行 rep－PCR 时一般都要设立一个阴性对照，以检测是否有上述污染的可能性存在。在进行实验时，除了 rep－PCR，为了结果的可信度还要再进行一些确证性的实验，确证实验可以是同 一问题的多重实验，或者是补充性实验，或者进一步的实验论证。

（七）流程七

带型的计算机分析：

rep－PCR 产生的基因组指纹图谱与产品上的条形码比较类似，每个菌株都有它独特的「条形码」，对图谱条形码的解读和分析也需要用计算机来进行。对带型最好的分析方法是采用密度曲线的方法。密度曲线的形成是基于基因组图谱条带的位置和扩增强度，在对不同菌株基因组图谱 进行比较分析的时候，采用密度曲线比较的方法可以缩小 DNA 样品浓度差异和不同背景带来的影响，两两密度曲线的比较分析是基于积矩或 Pearson 相关系数，釆用的软件为 GelComp，它可以将基因组指纹图谱的数据线性化，形成数据包，对数据进行分析可以形成菌株间亲缘关系的系统发生树。

① 在流行病研究致病菌株的时候，应当首先用生物分型法鉴定出致病菌的属、种，rep－PCR 方法可以在这个背景下更进一步确定出致病株，将此方法直接用于临床致病菌的鉴定无疑是耗时而且费力的。但是，在作微生物分类研究时，可以利用 rep－PCR 结果的带型情况，分析两种菌株 的亲缘关系。

② 经验证明不同菌株 rep－PCR 产生的指纹图谱带型具有很好的重复性。对于相同菌株不论是从同一平板上挑取的不同克隆，还是由同一菌株传代 10 次所得到的样品，它们所得到的 DNA 指纹图谱是一致的，并且呈现出特异性。

③ REPALL－I 和 REPALL－D 序列并不适合作为 rep－PCR 的引物，这是因为它们本身就是回文序列，可以形成茎环结构，并且它们可能形成引物二聚体。而引物 REP1R 和 REP2 与共有序列中的保守茎环相配对，可以与模板实现最佳的退火反应武。

④ 在同一菌种的不同菌株间分别进行 rep－PCR 和 ERIC－PCR，结果显示它们都具有一部分的相同带型，因此可以依此对特定菌种的菌株进行分类。由引物 ERIC1R 和 ERIC2 进行的 PCR 反应得到的产物带型不像引物 REP1R 和 REP2 的 PCR 结果那样复杂，因此更容易区分出种间的差别，然而由于基因组指纹图谱的复杂性降低了，这样就不容易对同一菌种的不同菌株进行区分。因此 REP 引物常用于菌株间的鉴定，ERIC 引物常用于菌种间的鉴定。

⑤ 假阴性结果的产生。假阴性结果产生的原因有如下可能：样品中有抑制 DNA 聚合酶活性的物质，DNA 靶序列的降解，或者试剂的问题。为了避免假阴性结果的产生，包含 PCR 反应混合液和已知目的 DNA 的模板应当包含在每次实验中。