共有序列巢式 PCR

共有序列巢式 PCR (consensus nested PCR)， 又称为共有引物巢式 PCR (consensus primer nested PCR)， 根据同一种属内较为保守的序列，设计简并引物，通常第一轮 PCR 引物的简并碱基较多，第二轮 PCR 引物的简并碱基较少一些，扩增长度为 200~300 bp。

共有序列巢式 PCR 的基本原理是利用软件进行严格的序列对比分析，从中找出保守的序列，在这部分序列中可能仍存在一些核苷酸的多样性，则在具有多样性核苷酸的位置上设计为简并碱基，将所出现的所有核苷酸多样性均要考虑，第二轮 PCR 扩增产物长度控制在 200～300 bp 左右。由于引物中简并碱基较多，要摸索适合的退火温度。

共有序列巢式 PCR 的常用应用领域如下：

（一）测序获得未知微生物的信息

对于某一种生物，例如病毒，种属内型别很多，但检测样本中的病毒型别又不确定，使用共有序列巢式 PCR 扩增获得目的序列，进而通过测序获得未知微生物的信息，是一种敏感而又简便易行的检测方法。

器材：PCR 扩增仪、电泳仪

试剂：

① 模板： 基因组 DNA 或 cDNA

② 2.5 mmol/L dNTP 混合液

③ 10 umol/L 四条特异引物： 两条外引物，两条内引物

④ TaqDNA 聚合酶及其 10× PCR 缓冲液

⑤ 高压灭菌去离子水

共有序列巢式 PCR 的基本过程可分为如下几步：

（一）引物设计

在共有序列巢式 PCR 中，引物设计最为重要。选择同一种属序列最为保守的区域，根据序列比对情况，设计引物。

（二）共有序列巢式 PCR 反应

A. PCR 反应体系：

设立 50 pl 的 PCR 反应体系，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入：

10× PCR 缓冲液 5 μl

DNA 模板 5 μl

2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

Taq DNA 聚合酶 （5 U/μl） 0.5 μl

10 μmol/L 的外引物 （P1、P2） 各 1 μl

H2O 至 50 μl

如果 PCR 仪没有热盖，在反应液上加一滴矿物油 （约 50 μl）。将 PCR 试管放入到 PCR 仪上。

B. 设置 PCR 反应条件：

预变性 94 ℃，3 min

变性 94 ℃，30 s

退火 55 ℃，30 s 30 个循环

延伸 72 ℃，60 s

延伸 72 ℃，7 min

PCR 反应中的温度要根据具体反应而定，一般来说每分钟合成 1000 bp 左右。

C. 进行第二轮 PCR 反应，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入：

10× PCR 缓冲液 5 μl

第一轮 PCR 产物 5 μl

2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

Taq DNA 聚合酶 (5 U/μl) 0.5 μl

10 μmol/L 的正反向内引物 （P3 ，P4） 各 1 μl

H2O 至 50 μl

PCR 反应条件同第一轮。

D. PCR 产物的检测

反应结束后，用 10 μl 第二轮 PCR 反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。

1. 引物设计尤为重要，在引物设计之前要搜集可能相关的所有 DNA 序列，利用软件进行严格的序列比对分析，从中找出最保守的序列，在这部分序列中可能仍存在一些核苷酸多样性，则在具有多样性核苷酸的位置上设计为简并碱基，将所出现的所有核苷酸多样性均要考虑，第二轮 PCR 扩增产物长度控制在 200~300 bp 左右。

2. 由于引物中简并碱基较多，要摸索适合的退火温度。