巢式 PCR

使用扩增片段的内外两对引物进行两轮 PCR 扩增来提高引物与目的基因片段的特异性和灵敏性，以防止非特异性结合和非特异性产物的生成。

常规使用的一对引物的 PCR 可能会发生引物与模板的非特异性结合，为了提高特异性，选用目的基因内外两层引物进行两轮扩增，在前一轮的产物中进行二次筛选，双重保险以获得特异性的目的片段。

常用于高遗传变异性的病毒检测以提高检测率，也可用于常规 PCR 扩增产物时，核酸胶检测产物弥散高亮，但未出现明显条带时；也适用于模板质粒质量差或丰度较低时。

试剂：

① 灭菌水

② Fast Pfu DNA 聚合酶及 PCR 缓冲液

③ 模板质粒以及内外两对引物

④ dNTP mix DNA 纯化回收试剂盒

仪器：PCR 扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、枪头和移液器

一、第一轮 PCR 扩增

目的 DNA 模板与第一对外侧的引物结合后进行 PCR 扩增。由于只有一对引物可能发生特异性结合，产物中会有目的基因片段和非特异性片段。

条件设置：

二、第二轮 PCR 扩增

使用目的基因内侧的第二对引物，即巢式引物，对第一轮的 PCR 产物进行扩增，双重筛选以调取目的基因片段。PCR 反应条件同第一轮。

三、PCR 产物的检测

将两轮 PCR 产物进行凝胶电泳分析，以检验产物片段大小是否正确，进行胶回收 DNA 纯化，转化后挑克隆送测序。

1、注意检测模板质粒质量以及各引物浓度；

2、外侧引物比内测引物的 Tm 值高 4 ℃ 以上；

3、外侧引物距离内侧引物要多于 6 bp；

4、第一轮 PCR 扩增时，应尽量摸索最低的外侧引物加入量，并增加扩增循环数，以消耗尽外侧引物，避免第二轮时继续扩增造成非特异性污染。

1、一轮用外侧引物 PCR 产物中出现非特异性条带

原因常见：

引物与靶序列不完全互补，非特异性结合用巢式 PCR 解决。但也可能是由于引物浓度过高、聚合形成二聚体/酶的质和量不佳/退火温度过低/ PCR 循环数过多所致，

对策：

必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93 ℃ 变性，65 ℃ 左右退火与延伸）等

2、PCR 扩增产物出现片状拖带/涂抹带

往往是由于模板质粒质量不好、酶量过多、dNTP 浓度过高、循环次数过多时引起，常规 PCR 出现非特异性结合的情况极少，建议先排查掉这些原因再进一步使用巢式 PCR。