PCR技术（十六）：PCR产物测序

PCR技术代替了为测序而反复进行的分子克隆和模板制备步骤。PCR技术与自动测序技术相结合后，它将成为一种最快、最有效的测定核苷权序列的方法。本章主要综述各种测模板的制备以及如何完成PCR产物的直接测序。与传统的将PCR片段克隆入质粒或病毒基因组相比，直接序列分析有两个主要的优点：

1)由于它是一个不依赖于生物体(如细菌、病毒等)的体外系统，因而它更容易标准化(即例于自化；

2)对于每个待 测样品，只需测定一个单链序列，因而它也就更快和更准确。相比之下，间接测序为了区别在PCR反应过程中由DNA聚合酶引入的随机错朽核苷酸所引起的原始基因组序列中的突变，以及由体外重组而产生的人工扩增产物，如产生镶嵌等位基因(混合克隆) 等，每个样品不得不测定几个PCR产物克隆的序列。

不需借助在细菌中克隆就可直接获得清蜥和准确的序列结果，其难易程度取决于：

1)只扩增靶序列的PCR引物的扩增能力(通常称为PCR特异性)；2用以获笪测序模板的方法。与引物物异性及模板制备有关的问题将在下面谈到。虽然DNA测序的化学法 (Maxam-Gilbrt)可以用来直接测序，但我们这里仅讨论Sanger的末端终止法。

最佳的PCR条件

PCR反应的特异性在很大程度上是由寡聚核苷酸引物的序列所决定的。对于特定的引物组，PCR的特异性可以由于采用最佳的反应条件、退火温度和PCR缓冲液中的MgCl2浓度而发生明显的变化。

如果用标准的1.5mM的MgCl2浓度不能得到所需的特异 性PCR产物，我们建议MgCl2的终浓度为1.4∽2.5mM之间，以0.2mM增长率来改变MgCl2 浓度，以选择最佳Mg++浓度。一个较常遇见的问题是，使PCR特异性达到最高的MgCl2 浓度导致PCR扩增失败(dropouts)。

这可能是由于模板DNA溶液中有较高的EDTA，它隆低了提供给Taq DNA聚合酶MgCl2量。因此，对于扩增溶解在TE(1mM EDTA)中的DNA， 我们建议用含2.0mM的MgCl2的PCR缓冲液。

PCR反应的温度范围包含有三个不同的恒定期:变性期、退火期和延伸期，还有它们之间的过渡期。为了获得用于序列分析的模板或杂交探针的单链DNA，通常并不需要改变参数。

凝胶纯化PCR扩增的靶序列

如果最佳PCR反应条件不能产生所需的特异性产物，可采用新的寡核苷酸重新进行扩增，或用凝胶电泳来分离不同的PCR产物，而后再各自重新扩增进行序列分析。长度不同的片段可以用琼脂糖凝胶电泳来分离:

1、片段大小在80-100bp时，可采用3%NuSieve1%普通琼脂糖或用聚丙烯酰胺胶来分离。　

2、从胶上切下含所南非PCR片段的薄片。

3、加入50∽100μlTE浸泡胶片，可反复冻融或放置几个小时使DNA从胶中扩散出来。

4、取少量(1-5%)进行第二次扩增，为得到纯净单一的产物，用于第二次PCR扩增的凝胶抽提物的量必须少于1ng。

5、现已发现琼脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物质。因而，如需重新扩增供Tab聚合酶测序用的片段，最好用丙烯酰胺电泳分离。

当用PCR引物扩增几个同样长度的相关序列时，如来自几个新近复制的基因，或重复序列或保守的信号序列(conserved signal sequences)的同样显子，可以通过下 列两种不同方法来改进电泳分离。

1)先用只切割某一模板的内切酶进行酶切，而后电泳纯化完整的PCR产物。

2)用可使核苷酸序列不同的扩增产物分开的电泳系统。下一个部份将讨论此类系统中的变性甲酰胺梯度凝胶系统。采用方法一时，必须事先了解在不同PCR产物中的内切酶位点。

杂合体的直接测序

当两个等位基因由于单一位点突变而产生差异时，用一个PCR引物直接进行测 序，能找出杂合位点。但是，带有几个点突变或短片段的插入/缺失的等位模板用PC R引物之一来直接测序，将产生复合序列带(compound sequencing ladders)。有四种方法可以确定几种点突在型并从杂合体中获得单个等位基因的序列：

1)克隆分离不同的模板；

2)在测序之前，利用模板之间核苷酸序列的差异，用电泳技术分离不同的模板；3)在测序反应中只启动一个等位基因；4)只扩增一个等位基因。

测序模板的制备

与PCR产物的直接测序有关的一些问题是变性后由于扩增片段的两条链可以迅速 结合起来，从而阻止了测序引物与它的互补序列退火，或阻止了引物──模板复合物 的延伸。在测序反应中，模板链重新结合使一小部份模析骖与测序从而弱化最终的测序条带。为减少此问题，可用改进的标准双链DNA测序法或用PCR制备单链模板。

双链DNA模板

有两种不同方法用来制备测序用的模板，目前都已用来测定共价闭环双链质粒模 板的序列。用这些方法来进行PCR产物的测序通常是较困骓的，因为短的线性模板比团环质粒的双链更易于重新结合。在这两种方法中，PCR片段可以由凝胶电胶或在电泳前先进行旋转透析(Spin-dialysis)纯化。

1、在室温下，模板先在0.2M NaOH中变性5分钟，冰冻，加入0.4倍的5M醋酸铵 (pH7.5)来中和反应。立即用四体积的无水乙醇沉淀DNA。在合适的退火温度下，加入测序缓冲引物。

2、在95℃下保温5分钟来变性模板，冰浴(或在干冰乙醇中)快速冷却离心管，以减少链的重新结合。加入测序引物并使反应达到合适的温度。测序引物在变性前或后加入都合适。