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随机错误掺入 PCR 构建突变体库

2024-05-14 PCR 加入收藏

简介随机错误掺入 PCR 构建突变体库，是在 PCR 中通过 DNA 聚合酶进行不正确拷贝，在整个 DNA 序列中进行散在的随机突变，使每一个分子带有一个或数个

简介

随机错误掺入 PCR 构建突变体库，是在 PCR 中通过 DNA 聚合酶进行不正确拷贝，在整个 DNA 序列中进行散在的随机突变，使每一个分子带有一个或数个突变。

原理

随机错误掺入 PCR 构建突变体库的基本原理是当 4 种核苷酸的任一种在 PCR 反应中是限量时，会发生碱基的错误掺入。进行 4 种 PCR 反应，每种耗尽不同的核苷酸，且含有高浓度的次黄票吟核苷酸 dITP，在缺乏正确核苷酸时，DNA 聚合酶经短暂停顿后，选择次黄嘌呤核苷酸或另外 3 种核苷酸的一种掺入到所缺乏核苷酸的位点上。由于所有 4 种碱基都能同次黄嘌呤配对，下一轮 PCR 循环中在错误掺入位点上发生突变的概率理论上可以达到 75%。
即便核苷酸的量是正常的，如果在 PCR 中使用不具有 3'—5『外切酶功能的 DNA 聚合酶，同样可以产生随机突变。在所有已经知道的 DNA 聚合酶中，Taq DNA 聚合酶产生的错误掺入率最高，每扩增一次，核苷酸错配率在 0.1X10-4〜2X10-4 之间，具体数字由反应条件决定。经过 20〜25 轮循环 PCR, 每个核苷酸产生的累积错误率约达 10-3。一般来说，这样的错误掺入率对于构建一个具有不同序列的变异库仍然不够，特别是对于扩增目的片段小于 1000 个核苷酸的情况。导致不足的另一个原因是，Taq DNA 聚合酶在普通 PCR 条件下总是有比较大的定向错掺趋势，即 A-T 对变 GC 对的倾向。通过调整反应条件可以解决这一问题，如提高 MgCl2 浓度以稳定非互补的碱基对，加入 MnCl2 以降低聚合酶对模板的特异性，增加 dCTP 和 dTTP 的浓度以促进错误掺入，增加 Taq DNA 聚合酶以促进延伸链在碱基错配位置后得以继续，最终使每一个核苷酸的错误率达到大约 7X10-3, 而且这种错误率没有序列倾向性。图解示意【】。

材料与仪器

器材：

PCR 扩增仪、电泳仪、水平电泳槽

试剂：

①10X 致突变 PCR 缓冲液：内含 70 mmol/L MgCl2，500 mmol/L KC1, 100 mmol/L Tris- HC1（pH8.3, 25 °C）, 1 g/L 明胶。

②10XdNTP 混合物：内含 2 mmol/L dGTP, 2 mmol/L dATP, 10 mmol/L dCTP 和 10 mmol/L dTTPo

③5 mmol/L MnCl2 水溶液：不与 10X 致突变 PCR 缓冲液混合。

④2 种寡核苷酸引物（10mol/L）。

⑤模板 DNA（lOng/ptDo

⑥Tag DNA 聚合酶。

⑦凝胶：含 0.5 g/mL 溴化乙锭的 1% 琼脂糖凝胶。

步骤