大引物 PCR 构建定点突变序列

大引物 PCR 构建定点突变序列只需要一个诱变引物，是目前以 PCR 为基础的诱变方法中最简单和经济的。

大引物 PCR 构建定点突变序列的基本原理是通过两个侧引物，和一个带有预设突变的内部诱变引物，获得定点突变产物。该方法包括两轮 PCR，需两个侧引物，一个带有预设突变的内部诱变引物。侧引物能够与克隆基因或临近载体序列互补。

理论上，诱变引物的扩增方向可以朝向任意的侧引物。然而，实际上诱变引物总是朝向两个侧引物较近的一个，这样能把大引物的长度保持最短。在大引物 PCR 中，第一 轮 PCR 是在诱变引物和较近的侧引物间进行，以野生型 DNA 为模板。

第一轮反应的产物（双链大引物）被纯化，并同另一侧引物一起进行第二轮 PCR，所得产物为包含突变的双链 DNA，大小为两个外侧引物间的距离。图解示意。

器材：PCR 扩增仪、电泳仪、水平电泳槽；

试剂：

① 10 × PCR 缓冲液：内含 15 mmol/L MgCl2，500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3，25 °C）；

② 10 × dNTP 混合物：内含 2 mmol/L dGTP，2 mmol/L dATP，2 mmol/L dCTP 和 2 mmol/L dTTP；

③ 3 种寡核苷酸引物；

④ 模板 DNA；

⑤ 热稳定 DNA 聚合酶；

⑥ 凝胶：含 0.5 g/mL 溴化乙锭的 1% 琼脂糖凝胶；

耗材：PCR 管、移液枪头。

大引物 PCR 构建定点突变序列的基本过程可分为如下几步：

① 在一支 PCR 反应管中混合以下试剂，组成第一轮 PCR 反应：10X PCR 缓冲液 10 μl，模板 DNA 约 10 pg，10X dNTP 混合物 10 μl，热稳定 DNA 聚合酶 1~2U，10 umol/L 突变引物 1 μl，水加至 100 μl，10/umol/L 对应侧引物 1 μl。 

② PCR 扩增：94 °C 预变性 4 min；循环 25 次，每次 94 ℃ 变性 1 min，50 °C 退火 1 min，72 °C 延伸 1 min，最后一次延伸 10 min（可根据引物序列和扩增片段长度调节退火温度和延伸时间）。

③ 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 反应产物。

④ 纯化 PCR 产物（选做）。

⑤ 在第二支 PCR 反应管中混合以下试剂，组成第二轮 PCR 反应： 10X PCR 缓冲液 10 μl，模板 DNA 约 10 pg，10X dNTP 混合物 10 μl，热稳定 DNA 聚合酶 1~2U，第一轮 PCR 产物 10 pmol，水加至 100 μl，10 μmol/L 另一侧引物 1 μl。

⑥ PCR 扩增：94 °C 预变性 4 min；循环 25 次，每次 94 °C 变性 1 min，50 °C 退火 1 min，72 °C 延伸 1 min，最后一次延伸 10 min（可根据引物序列和扩增片段长度调节退火温度和延伸时间）。

⑦ 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 反应产物。

⑧ PCR 产物克隆，筛选突变体，分析扩增的 DNA 片段的全序列。