体外培养细胞和组织细胞DNA PCR反应模板的制备

1g哺乳动物细胞，可以得到约2mg DNA。

试剂与配制

1. 磷酸缓冲液；

2. 酚/氯仿/异戊醇25:24:1；

3. 7.5mol/L醋酸铵；

4. 100%和70%乙醇；

5. TE缓冲液；

6. 消化缓冲液：100mmol/L NaCl、pH8.0 10mmol/L Tris.Cl、pH8.0 25mmol/L EDTA、0.5%SDS、0.1mg/ml蛋白酶K（临用前加入）。

操作方法

1. 标本的制备

A）组织标本的制备：①新鲜的生物组织尽可能迅速用剪刀清除筋膜等结缔组织，快速置于液氮或70℃冰箱中。如果是肝组织块,应立即清除含高降解酶的胆囊，②取200mg～1g组织，磨碎组织块，使之成为粉沫状；③每100mg组织中加入1.2ml消化缓冲液，必须无凝块或结块。

B）组织培养细胞的制备：①悬浮培养细胞直接经2500r/min离心10min，弃上清，收集细胞；贴壁细胞用胰酶消化后，1200r/min离心5min，弃上清，收集细胞；②加1～10ml预冷的PBS重悬细胞，1200r/min离心5min，弃上清；③重复步骤②，再用PBS洗一次后，加等体积的消化缓冲液。若细胞数低于3×107 ，加0.3ml消化缓冲液。若细胞数高于108 ，加1ml消化缓冲液。

2. 细胞或组织样品在50℃下轻轻振摇保温12～18h（样品呈粘性状，经12h孵育后，组织样品几乎全部溶解，无块状，并且组织培养细胞应该比较清亮）。

3. 用等体积的酚/氯仿/异戊醇抽提，3000r/min离心10min，如果分离不理想，可再次加入消化缓冲液，但不加蛋白酶K，重复离心。如果在两相之间有一层致密的白色物质，需重复抽提。

4. 将上层水相移至一新的试管内，加1/2体积的7.5mol/L醋酸铵和2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，3000r/min离心2min，回收DNA。

5. 加70%乙醇洗DNA沉淀，倾去乙醇，空气干燥DNA沉淀团。

6. 将DNA沉淀重悬于TE缓冲液中，可以在室温下轻轻振荡混匀和65℃数小时使之溶解。加用0.1%SDS溶解的1μg/ml RNA酶，37℃孵育1h，再用上述方法抽提，乙醇沉淀。

7. 4℃或者0℃贮存。