双标签的分离实验

一、用 NlaIII 消化双标签，释放接头

1.向 480ul 已纯化的 PCR 产物中加入下列成分：

2.在 37℃ 下消化 Ih(不要热失活酶，否则将致使 22~26bp 的小双标签变性)。

3.消化产物可以在 4℃ 下过夜保存，或者用 Dynabead 进行生物素化 PCR 产物的提取。

二、用 Dynabead 提取生物素化产物

注意：本步骤中，由于生物素链霉抗生物素的捕获，去除了接头及未酶解或者部分酶解的产物，从而富集反应产物。

1.荡链霉抗生物素 M-280 Dynabead 1 min，使其重新成为悬液。

2.将 3 份 IOOul 的 Dynabead 转移入 1.5 ml 的 Eppendorf 试管中。

3.用磁设备固定磁珠，弃去上清液。

4.200ulIX 结合及冲洗缓冲液重悬冲洗 3 次，固定磁珠，弃去冲洗液。

5.NlaIII 酶解过的双标签（体积为 600ul) 分为 200ul 的三份；向三份冲洗过的磁珠中每份加入 200ul。

6.混匀后，在室温下孵育 30 min(每 IOmin 混合 1 次)。

7.用磁设备固定磁珠，并将上清液移入一新的 1.5 ml 的 Eppendorf 试管中。

8.为使上清液发生沉淀，需加入：

一 3ul 糖原

一 800ul 乙醇

9.在干冰/乙醇上冰浴 15 min。

10.在 4℃ 下，以 13000r/rnin 在微量离心机中离心 15 min。

11.乙醇洗涤沉淀 1 次，自然风干。

12.新使其悬浮于 30ul 以的 LoTE 中。

13.将全部样本上取样于 8 道的 I2% 的聚丙烯酰胺凝胶上，用 IObpladder 作为分子量标准（注意：我们推荐用含有橙黄 G 的上样缓冲液，可防止和 22~26bp 双标签的共同移动)。

14.室温、50V 电压下，进行凝胶电泳 2.5 h, 或者直到澄黄 G 在凝胶的底部为止。

15.EB 染色。

16.凝股上切除双标签带，此带为 22~26bp(图 2-5), 应在士 40bp 的接头的下面。

17.用 4 个 0.5 mlPCR 试管分装切下的聚丙烯酰胺凝胶片段，各小试管均用 21 号针头在底部穿有小孔。将 PCR 试管放入一个 1.5 ml 的 Eppendorf 试管中，并以 13000 min 在微量离心机中离心 5 min 使聚丙烯酰胺凝胶成为碎片，移开 0.5 mlPCR 试管，然后在每个试管中加入 300ul 的 LoTE，涡漩振荡，然后在 37℃ 下孵育 15~30 min。

18.将聚丙烯酰胺凝胶混悬液移入一个 SpinX 柱中在微离心机中以 13000r/min 旋转 5 min。

19.将每份滤液移入新的 1.5 ml 的 Eppendorf 试管中，并用等体积的 PCI 抽提（实验方案 A，第 2 步)。

20.加入下列物质使液体发生沉淀：

一 lOOullOmol/L 的乙酸铵

一 3ul 的糖原

一 900ul 乙醇

21.在干冰/乙醇上冰浴 15 min。

22.在 4℃ 下，以 13000r/min 在微离心机中离心 5 min。

23.以 70% 乙醇冲洗冲洗沉淀 2 次，然后晾干。

24.在总体积为 7ul 的 LoTE 中重新溶于此 4 份沉淀物。