免疫荧光染色操作步骤以及目的

一、实验目的

通过细胞免疫荧光技术，检测TRPV4、BK蛋白在组织中的表达情况。

二、实验样品及分组

样本：大鼠附睾组织

指标：TRPV4、BK

三、实验结果

四、实验结论

IF染色结果显示：

TRPV4、BK蛋白在组织中有特异性表达，阳性染色为相应荧光素标记的绿色和红色，胞核为DAPI标记的蓝色。

五、实验材料

1、主要仪器

2、主要试剂

五、实验原理

免疫荧光细胞是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

七、实验步骤

1.60℃烤片30 min；

2.切片脱蜡至水：先将切片置于二甲苯中10 min，2次。然后依次在100%，95%，85%和75%乙醇，每级放置5-10 min。再用蒸馏水浸洗5 min；

3.热修复抗原：将切片浸入柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）,微波炉高火加热8min后拿出，冷却至室温。冷却后PBS（pH7.2~7.6）洗涤3 min x 3次；

4.加入3% H2O2，室温10分钟以灭活内源性酶。PBS冲洗3 min x 3次；

5.血清封闭：切片滴加血清放入湿盒中，室温20 min。甩干不洗；

6.孵育一抗：滴加适当稀释的一抗，对照组滴加等量PBS，4℃冰箱过夜；；

7.加荧光二抗：PBS浸洗3次，每次3 min，吸干切片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中37℃孵育1h，PBS浸洗3次；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量避光操作；

8.复染核：滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，PBS 4次洗去多余的DAPI；；

9.封片：防荧光淬灭封片剂封片、荧光显微镜观察。