如何使昆虫细胞适应新的培养液

市场上供应的大多数培养液的配方非常接近，这使得细胞很容易适应新的培养液。这里我将详细介绍一个方法，这个方法是保守的，在大多数情况下可以进行删减一些步骤。最简单最节省时间的情况是把细胞直接分装到新的培养液中，观察几代以保证细胞的生长参数是可以接受的。这个方法适于悬浮细胞，不过也很容易扩展到贴壁细胞。

细胞的生长参数

1．翻倍时间（Doubling Time）

细胞的翻倍时间在评价昆虫细胞健康程度的参数中是最容易测量的。翻倍时间应该在细胞处于对数期复制时测量，对于Sf9和Sf21细胞来说通常是介于16-24小时之间，不过大多数在20-22小时。

dt=t×ln2/ln(Ct/Co)，其中dt为翻倍时间，Co为起始细胞数目，Ct为经过时间t后的细胞数目，t为Co和Ct两次计数之间的间隔时间，所有的时间都以小时为单位。

2．细胞大小（Cell Size）

细胞的大小是监测细胞健康程度的一个非常有用的参数。如果细胞是健康的，细胞的大小均一，都处于该细胞株体积正常变化范围的下限。细胞的大小在不同的细胞株变化是很大的。对于我用过的Sf9和Sf21，典型的直径是16-18mm，不过我知道有些细胞株小至14 mm或者大至19 mm仍然很健康。

3．滞后期（Duration of Lag）

当细胞的密度较低时，会有一个滞后期，其长短取决于分装或者传代后细胞的密度。一般说来，该密度越低，滞后期越长。对于一个特定的细胞株来说，当这个密度高出一个阈值时，滞后期的长短与密度无关；而低于一个阈值时，滞后期无限长，细胞不再增殖。

4．低密度分装极限（Low Density Split Tolerance）

能够在一个较短的滞后期（小于12小时）复苏的细胞形状较好。不过这是细胞株的特性，需要进行实验来确定你的细胞株的密度极限。我的细胞株有些在分装成密度为5×104细胞/ml时仍然可以很好复苏，有些细胞株分装成5×105细胞/ml就不能复苏了。

5．高密度极限（High Density Maximum）

这是你的细胞能生长的最大密度，高于这个密度你的细胞将进入平台期。这个指标既和细胞株有关，又和使用的培养液有关。我建议先把你的细胞株培养至平台期，然后把一些分装到新鲜的培养液中以后，使剩下的继续生长至平台期，同时密切监测细胞状况。一般来说，细胞的培养要避免密度超过高密度极限的80%。对于我培养的细胞，这个极限值从2×106至12×106细胞/ml不等。

实验步骤

第一阶段：

1．准备合适体积的由25%体积新培养液和75%旧培养液（即细胞原先适应的培养液）组成的混合培养液I。

2．将细胞以通常分装时使用的最低分装密度的两倍分装到混合培养液I中。

3．使细胞生长到通常培养时的较高密度，监测细胞生长参数。

4．继续以步骤2中的密度分装细胞到新鲜的混合培养液I中，直到生长参数达到可以接受的水平。有时候分装一次就可达到要求。

5．一旦细胞稳定下来，以通常使用的最低分装密度分装细胞至新鲜的混合培养液I中，同样监测细胞参数。

6．细胞达到较高密度后，继续以步骤5中的分装密度把细胞分装到新鲜的混合培养液I中，直到细胞的生长参数达到可以接受的水平。

7．如果细胞恢复到正常状态，进行第二阶段的实验。

8．如果细胞不能达到正常状态，新培养液可能不适于培养这种细胞。

9．如果细胞在新培养液中的生长参数达到平衡状态，虽然与正常状态不同，但是可以为实验接受，也可进行第二阶段的实验。

第二阶段：

1．准备适量的由50%新培养液和50%旧培养液组成的混合培养液II。

2．将细胞以两倍最低分装密度分装至混合培养液II中。

3．如第一阶段一样，监测细胞生长指数，使细胞达到稳定状态。然后将分装密度降到最低分装密度，再使细胞达到稳定状态。

第三阶段：

步骤同第一阶段和第二阶段，使细胞适应混合培养液III（75%新培养液和25%旧培养液）。

第四阶段：

1．步骤同第一阶段、第二阶段和第三阶段，使细胞适应新培养液。

2．当细胞在新培养液中达到稳定后，监测细胞的生长指数，看是否波动过大。