利用 PCR 进行多位点的体外基因定点突变

在蛋白质结构功能研究中，有时需要在多个氨基酸位点同时制作突变。以往这样的突变很难实现，随着 PCR 技术的逐步发展，对 DNA 序列上多个位点同时突变成为可能。原理利用 PCR 进行多位点的体外基因定点突变的基本原理是利用 PCR 的引物设计灵活性，在扩增中直接引入突变。

通过设计引物导入突变位点，和高保真 Taq DNA 聚合酶，以双链质粒为模板进行 PCR 反应；对 PCR 产物末端进行补平处理及 5'-端磷酸化处理；再用连接试剂进行自身连接（环化反应）；然后转化、提取突变体 DNA。

试剂：

① 引物

② DNA 聚合酶

③ 模板

④ 大肠杆菌感受态细胞

⑤ Dpn1 内切酶

仪器：

① PCR 仪

② 电泳仪

③ 培养箱

利用 PCR 进行多位点的体外基因定点突变的基本过程包括以下几步：

（1）用 PCR 方法合成带有多个突变位点的突变链。反应体系含超螺旋双链 DNA 模板、2 个以上含突变位点的寡核苷酸引物以及高保真 DNA 聚合酶等。

（2）采用限制性内切核酸酶 Dpn1 对 PCR 产物进行切割。Dpn1 特异识别并切割甲基化或半甲基化的位点。因模板 DNA 来自甲基化控制（dammethylaled）的菌株，所以 Dpn1 可将母代 DNA 模板切割成碎片。PCR 产物经 Dpn1 作用后，即可得到含多个突变位点的单链 DNA。

（3）将单链 DNA 转化至合适的宿主细胞，扩增为双链 DNA。提取双链的质粒 DNA，采用合适的方法进行突变鉴定。