RIP检测实验操作步骤

一、RIP检测原理与实验原理

RIP实验原理：RIP实验是研究RNA-蛋白之间的相互作用，运用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，通过免疫学方法将RNA-蛋白复合物一起分离出来，通过对目的片段的纯化与检测（结合的RNA序列通过microarCALU-1y（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定），从而分析蛋白质和RNA相互作用的信息。

RIP检测实验准备：

1、仪器准备：台式冷冻离心机、涡旋振荡器、电子天平、PCR仪、移液器、凝胶成像系统、电泳仪、水平电泳槽、洁净工作台、-80度冰箱、数显恒温水浴锅

2、试剂准备：无水乙醇、苯酚：氯仿：异戊醇、RIP试剂盒、1.5 mL EP管、2×PCR MIX、IGF2BP2抗体

二、RIP检测实验操作步骤

1、设计引物

2、细胞裂解

（1）加入1 mL PBS洗涤细胞，室温1000 rpm离心5 min收集细胞弃上清；重复一次。

（2）细胞沉淀中加入0.9 mL polysome lysis buffer，9µL Protease inhibitor，4.5µL RNase inhibitor涡旋混匀，冰上放置10 min。

3、去除DNA

（1）细胞裂解液中加4.5μL DNase salt stock、10μL DNase(20 U)，37℃温育10 min。

（2）转移样品到冰浴环境，快速加入4.5μL 0.5 M EDTA、1.8μL 0.5 M EGTA、9μL DTT，混匀。

（3）4℃，16,000 g离心10 min转移上清至新的无RNase离心管中。

4、平衡protein A/G

（1）每组RIP样品准备20µL protein A/G beads，加入0.5 mL polysome lysis buffer，颠倒混匀，磁力架上去上清；重复洗一次。

（2）加入20µL polysome lysis buffer恢复初始体积。

5、免疫沉淀

（1）将细胞裂解样品按照0.8 mL（IP）、0.1 mL（Input）分成两份，Input样品-80℃保存备用。

（2）IP样品加入实验抗体或者IgG（阴性对照），垂直混匀器4℃孵育16 h（过夜）。

（3）IP样品加入准备好的20µL protein A/G beads，垂直混匀器4℃孵育1小时，磁力架收集磁珠并去上清。

（4）IP样品加入0.5 mL polysome washing buffer 1、5µL DTT洗涤三次去上清，每次4℃孵育5分钟。

（5）IP样品中加入94.5μL polysome washing buffer 1、0.5μL DNase salt stock、5μL DNase(5 U)，37℃温育10 min后去上清。

（6）IP样品加入0.5 mL polysome washing buffer 2、5µL DTT洗涤两次去上清，每次4℃孵育5分钟。

（7）IP样品加入100µL polysome elution buffer、1µL DTT及2µL proteinase K重悬珠子，Input样品加入1µL DTT及2µL proteinase K。

（8）55℃孵育1 h，洗脱RNA，磁力架收集磁珠转移上清至新的无RNA酶离心管中。

6、提取RNA

（1）上清加入等洗脱体积(100µL)苯酚-氯仿-异戊醇混合液到IP和Input样品，颠倒混匀15秒。

（2）13000 g，4℃离心10分钟，收集上层水相，转移到新无RNA离心管中。

（3）加入1µL Glycogen，10µL sodium acetate及250µL 100%ethanol充分颠倒混匀。

（4）–20℃静置3 h到过夜沉淀RNA样品。

（5）4℃，16000 g离心30分钟，弃上清。

（6）加入1 mL预冷的80%乙醇，4℃，16100 g离心10分钟，弃上清，室温风干10分钟。

（7）加入30µL RNase-free water溶解RNA，-80℃保存。

7、RNA检测

（1）取2μL RNA样品检测RNA浓度。

7.8结合RNA效率验证（PCR)

（1）参考逆转录试剂盒说明书逆转录RNA样品。

（2）参考PCR试剂盒配置反应体系进行PCR，取10µL PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳。