细胞技术

亚硫酸氢钠测序（BSP）实验步骤

2025-02-07 细胞技术加入收藏

1、引物设计在GenBank上找到待检基因启动子区的原始序列，输入到“MethPrimer”软件中，输入启动子序列，选择“Pick primers for bi

1、引物设计

在GenBank上找到待检基因启动子区的原始序列，输入到“MethPrimer”软件中，输入启动子序列，选择“Pick primers for bisulfite sequencing PCR or restriction PCR ”，其他参数选择程序默认值，点击“Submit”，“MethPrimer”软件即可显示预测的启动子序列的CpG岛，及引物的相应位置，同时也显示设计的BSP引物。选择多对引物进行预实验，最终确定引物序列。

2、基因组提取

使用天根的TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（实验步骤见PDF:TIANamp Genomic DNA Kit），分别提取各样本基因组。提供的细胞量要求大于10^6个。提取浓度在100-400 ng/μL之间，OD 260/280均在1.8-2.0之间，提取质量合格。

3、亚硫酸氢钠修饰基因组DNA

（1）将提取获得的基因组DNA 3μg以无菌双蒸水稀释至50μl，然后加入NaOH（终浓度为0.2 M）在42℃水浴变性30 min。

（2）依次加入30μl 10mM对苯二酚（氢醌）、520μl 3 M亚硫酸氢钠（pH=5.0要求精准）至上述水浴后混合液中，轻柔颠倒混匀。

（3）加入200μl石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化；50℃避光水浴16h。

4、修饰后DNA纯化回收

修饰后的DNA使用纯化试剂盒进行过柱纯化，回收后用50µl无菌双蒸水溶解，并测定浓度。

5、PCR扩增

PCR引物设计、退火温度选择、Taq酶及Buffer的选择都会影响扩增的成败，需要不断优化。

6、扩增产物回收

将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，进行胶回收，步骤如下：在紫外灯下，切下包含目的片段的胶条。用天平称量总重量并减去空管的重量算出凝胶的重量，按100mg=100µL来计算凝胶的体积，并加入1倍凝胶体积的Binging Solution置于65℃水浴锅内将凝胶彻底融化。期间适当摇晃EP管，加快凝胶的溶解。

将上述液体全部转移到滤柱内，13000转离心30S（可重复一次）。然后弃掉管内液体，向柱内加入500µL的WA Solution，13000转离心30S。弃掉管内液体，再向柱内加入500µL的Wash Solution，13000转离心30S（可重复一次）。然后空离3 min。将滤柱放置在一个新的1.5mL EP管中，室温晾干。最后在柱子内加入35µL的ddH2O，静置5min，13000转离心90s。为了提高回收率，可将溶解的DNA再次加入柱子内离心一分钟。弃掉柱子，回收的即为扩增产物片段，并测定浓度。