GST pulldown实验操作步骤

一、GST-a融合蛋白的制备

1、GST-a融合蛋白的表达

(1)将目的蛋白与GST的重组质粒转化到BL21菌株中；

(2)挑取单克隆到含有5mL LB培养基（加入5μL氨苄）的10 mL试管里，37℃恒温振荡培养箱中培养过夜；

(3)将培养菌液转移到含有500mL LB（含500μL氨苄）的1L锥形瓶中，37℃，200 rpm培养数小时；

(4)测定OD600值，当OD600达到0.6左右时，加入适当浓度的IPTG，在20℃，200rpm条件下培养10-16h（通常需要进行预实验以确定最佳IPTG浓度、诱导温度和时间）；

(5)诱导适当时间后，将菌液分次倒入50 mL离心管中，4℃4000 rpm离心10分钟，然后弃去上清，收集管底菌体，如暂时不用，可将菌体保存于-80℃冰箱中；

(6)先加入少量PBS于离心管中，离心5-10 min后弃去上清，再按每10 mL菌液沉淀1 mL PBS的量加入相应的PBS，涡旋振荡，使菌体沉淀充分溶解于PBS溶液中；

(7)把混合菌体置于冰水浴中，用超声仪进行破碎。每次超声破碎20 s，间隔30 s（破碎时间、破碎次数和间隔时间视具体情况而定），经过适当时间超声后，溶液会显得澄清；

(8)将超声后的溶液4℃4000 rpm离心10分钟，上清液转移至新的离心管中，-80℃保存备用。

2、GST-a融合蛋白的纯化

(1)在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积50%Glutathione Sepharose 4B，4℃摇床上缓慢摇动30~60 min;

(2)4℃，4000rpm离心5 min，弃去上清，该Sepharose上结合了GST-a融合蛋白；

(3)加入200μL预冷的PBS溶液，轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤一次，4℃，4000 rpm离心5 min，弃去上清，重复此步骤3次；

(4)最后一次用移液枪吸走珠子表面的液体，但注意不要吸走珠子，即可获得结合GST-a的Sepharose。

二、体外蛋白的结合

1、将结合有GST-a融合蛋白的Sepharose 4B悬浮在适量体积的缓冲液中，加入20μL含有b蛋白的溶液，同时采用结合有GST蛋白的Sepharose作为阴性对照，在摇床上晃动4-8h（4℃）；

2、4℃，4000 rpm离心5 min，弃去上清液；

3、沿壁加入200μL预冷的缓冲液对Sepharose进行洗涤，

4、4℃，4000rpm离心5 min，弃上清，该步骤重复3次；

5、吸干Sepharose上面的液体后，加入20ul 1×蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴5 min，放入-20℃冰箱备用；

6、通过SDS-PAGE和Western blot进行检测。