体外转录合成单链RNA探针
原理制备特异性的单链 RNA 探针不仅比 DNA 探针更容易，在杂交反应中一般也比具相同比活性的 DNA 探针产生更强的信号，这可能是由于含有 RNA 的杂合链
原理
制备特异性的单链 RNA 探针不仅比 DNA 探针更容易，在杂交反应中一般也比具相同比活性的 DNA 探针产生更强的信号，这可能是由于含有 RNA 的杂合链固有的更高稳定性的缘故（Casey and Davidson 1977)。虽然 DNA 探针仍普遍地应用于 Northern 和 Southern 杂交，但当分析哺乳动物基因的转录时，放射性标记的 RNA 目前是首选探针。由于 RNA 酶 A 既耐用又容易控制，可用 RNA 酶 A 来消化 RNA-RNA 杂合体，而不必用特异性 S1 核酸酶来消化 DNA-RNA 杂合分子，RNA 酶 A 可在较宽的浓度范围内使用而不影响实验结果（Zirmetal. 1983; Mehonetal. 1984)。
材料与仪器
限制性内切核酸酶 RNA 聚合酶 胰腺 DNA 酶Ⅰ 模板 DNA
乙酸铵 牛血清白蛋白 DTT 乙醇 酚 氯仿 胎盘 RNA 酶抑制剂 醋酸钠 转录缓冲液 rNTP 溶液
琼脂糖凝胶 微量离心管 Sephadex G-50 离心柱 水浴
乙酸铵 牛血清白蛋白 DTT 乙醇 酚 氯仿 胎盘 RNA 酶抑制剂 醋酸钠 转录缓冲液 rNTP 溶液
琼脂糖凝胶 微量离心管 Sephadex G-50 离心柱 水浴
步骤
一、材料
1. 缓冲液与溶液
乙酸铵（10 mol/L）
牛血清白蛋白（2 mg/ml，组分 V，Sigma 公司）
DTT ( 1 mol/L)
乙醇
酚：氯仿（1:1，V/V)
胎盘 RNA 酶抑制剂（20 单位/μl）
醋酸钠（3 mol/L，pH 5.2)
10X 转录缓冲液（400 mmol/L Tris-Cl ( 37℃ 下 pH 7.5)，60 mmol/L MgCl2，20 mmol/L 盐酸亚精胺（spermidine HCl )，50 mmol/L NaCl）
2. 酶与缓冲液
适当的限制性内切核酸酶
T3、T7 或 SP6 噬菌体依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶
无 RNA 酶的胰腺 DNA 酶Ⅰ (1 mg/ml)
3. 凝胶
琼脂糖凝胶（0.8%~1.0%)
4. 核酸与寡核苷酸
含 rATP、rCTP、和 rUTP 各 5 mmol/L 的 rNTP 溶液
rGTP ( 0.5 mmol/L)
模板 DNA
5. 放射性复合物
[α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性 400~3000 Ci/mmol）
6. 专用设备
微量离心管（0.5 ml)
Sephadex G-50 离心柱，用 10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)平衡
预热至 40℃ 的水浴
二、方法
1. 用适当的限制酶消化超螺旋质粒 DNA 制备 5 pmol 的线性模板 DNA。取一小份消化的 DNA (100 ng) 进行琼脂糖凝胶电泳分析。如有必要，再补加限制酶继续温育，直至不再残存痕量的未消化 DNA。
2. 如必须用产生 3' 突出端的限制酶如 PstI 或 SstI，则应用噬菌体 T4 DNA 聚合酶在四种 dNTP 的存在下处理消化的 DNA 片段，以除去产生的 3' 突出端。
3. 用酚: 氯仿抽提及用标准乙醇沉淀纯化模板 DNA。将 DNA 溶解于水，使其终浓度为 100 nmol/L ( 如 3kb 质粒为 200 μg/ml)。
4. 将下列前六种组分温育至室温，在一个灭菌的 0.5 ml 微量离心管中，室温下以下列顺序混合：
模板 DNA 0.2 pmol（3 kb 质粒为 400 ng）
无 RNA 酶的水 加至 6 μl
5 mmol/L rNTP 浓液 2 μl
100 mmol/L DTT 2 μl
10X 转录缓冲液 2 μl
2 mg/ml 牛血清白蛋白 1 μl
10 mCi/ml [α-32P] rGTP 5 μl
( 比活性 400~3000 Ci/mmol)
轻弹管外壁以使各组分混合。然后加入：
胎盘 RNA 酶抑制剂（10 单位） 1 μl
噬菌体依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶（约 10 单位) 1 μl
轻敲管壁外侧使反应物混合，离心 1~2s 以使所有液体沉降到管底。37℃（T3 和 T7 噬菌体依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶）或 40℃（SP6 噬菌体依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶）下温育反应物 1~2 h。
5. ( 任选）如需全长转录物，可加入 2 μl 0.5 mmol/L rGTP，在适宜该聚合酶的温度下再温育 60 min。
6. 加入 1 μl 1 mg/ml 无 RNA 酶的胰 DNA 酶 I 以终止体外转录反应。轻弹管外壁以混合各试剂。37℃ 温育反应混合物 15 min。
7. 加入 100 μl 无 RNA 酶的水，通过用酚: 氯仿抽提纯化 RNA。
8. 将水相转移至一个新的微量离心管，用下列三种方法中的任一方法将放射性标记的 RNA 与不需要的小分子 RNA 和 rNTP 分开：
(1) 用乙醇沉淀纯化 RNA
① 在水相中加入 30 μl 10 mol/L 醋酸铵，混匀后再加入 250 μl 用冰预冷的乙醇。置 于冰上 30 min 后，在微量离心机中 4℃ 下以最大速度离心 10 min 收集 RNA。
② 小心地尽量吸去其中的乙醇，然后将管子敞开口，放置于实验台上数分钟，使剩余的可见的乙醇挥发干净。把 RNA 重溶于 100 μl 无 RNA 酶的水中。
③ 加 2 倍体积冰预冷的乙醇至小管内，将 DNA 贮存于 -70℃ 备用。
(2) 通过离心柱层析纯化 RNA
① 将 Sephadex G-50 离心柱平衡于 10 mmol/L Tris-Cl 中（pH 7.5) 灭菌处理。
② 用离心柱层析纯化 RNA。
③ 将洗脱的 RNA 贮存于 -70℃ 以备用。
(3) 通过凝胶电泳纯化 RNA
① 准备中性聚丙烯酰胺凝胶。
② 在水相中加入适当的凝胶上样缓冲液，通过凝胶电泳纯化 RNA。
③ 通过放射性自显影定位 RNA。
④ 用挤碎和浸泡的方法从凝胶块中纯化 RNA。
⑤ 将 RNA 贮存于 -70℃ 备用。
1. 缓冲液与溶液
乙酸铵（10 mol/L）
牛血清白蛋白（2 mg/ml，组分 V，Sigma 公司）
DTT ( 1 mol/L)
乙醇
酚：氯仿（1:1，V/V)
胎盘 RNA 酶抑制剂（20 单位/μl）
醋酸钠（3 mol/L，pH 5.2)
10X 转录缓冲液（400 mmol/L Tris-Cl ( 37℃ 下 pH 7.5)，60 mmol/L MgCl2，20 mmol/L 盐酸亚精胺（spermidine HCl )，50 mmol/L NaCl）
2. 酶与缓冲液
适当的限制性内切核酸酶
T3、T7 或 SP6 噬菌体依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶
无 RNA 酶的胰腺 DNA 酶Ⅰ (1 mg/ml)
3. 凝胶
琼脂糖凝胶（0.8%~1.0%)
4. 核酸与寡核苷酸
含 rATP、rCTP、和 rUTP 各 5 mmol/L 的 rNTP 溶液
rGTP ( 0.5 mmol/L)
模板 DNA
5. 放射性复合物
[α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性 400~3000 Ci/mmol）
6. 专用设备
微量离心管（0.5 ml)
Sephadex G-50 离心柱，用 10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)平衡
预热至 40℃ 的水浴
二、方法
1. 用适当的限制酶消化超螺旋质粒 DNA 制备 5 pmol 的线性模板 DNA。取一小份消化的 DNA (100 ng) 进行琼脂糖凝胶电泳分析。如有必要，再补加限制酶继续温育，直至不再残存痕量的未消化 DNA。
2. 如必须用产生 3' 突出端的限制酶如 PstI 或 SstI，则应用噬菌体 T4 DNA 聚合酶在四种 dNTP 的存在下处理消化的 DNA 片段，以除去产生的 3' 突出端。
3. 用酚: 氯仿抽提及用标准乙醇沉淀纯化模板 DNA。将 DNA 溶解于水，使其终浓度为 100 nmol/L ( 如 3kb 质粒为 200 μg/ml)。
4. 将下列前六种组分温育至室温，在一个灭菌的 0.5 ml 微量离心管中，室温下以下列顺序混合：
模板 DNA 0.2 pmol（3 kb 质粒为 400 ng）
无 RNA 酶的水 加至 6 μl
5 mmol/L rNTP 浓液 2 μl
100 mmol/L DTT 2 μl
10X 转录缓冲液 2 μl
2 mg/ml 牛血清白蛋白 1 μl
10 mCi/ml [α-32P] rGTP 5 μl
( 比活性 400~3000 Ci/mmol)
轻弹管外壁以使各组分混合。然后加入：
胎盘 RNA 酶抑制剂（10 单位） 1 μl
噬菌体依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶（约 10 单位) 1 μl
轻敲管壁外侧使反应物混合，离心 1~2s 以使所有液体沉降到管底。37℃（T3 和 T7 噬菌体依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶）或 40℃（SP6 噬菌体依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶）下温育反应物 1~2 h。
5. ( 任选）如需全长转录物，可加入 2 μl 0.5 mmol/L rGTP，在适宜该聚合酶的温度下再温育 60 min。
6. 加入 1 μl 1 mg/ml 无 RNA 酶的胰 DNA 酶 I 以终止体外转录反应。轻弹管外壁以混合各试剂。37℃ 温育反应混合物 15 min。
7. 加入 100 μl 无 RNA 酶的水，通过用酚: 氯仿抽提纯化 RNA。
8. 将水相转移至一个新的微量离心管，用下列三种方法中的任一方法将放射性标记的 RNA 与不需要的小分子 RNA 和 rNTP 分开：
(1) 用乙醇沉淀纯化 RNA
① 在水相中加入 30 μl 10 mol/L 醋酸铵，混匀后再加入 250 μl 用冰预冷的乙醇。置 于冰上 30 min 后，在微量离心机中 4℃ 下以最大速度离心 10 min 收集 RNA。
② 小心地尽量吸去其中的乙醇，然后将管子敞开口，放置于实验台上数分钟，使剩余的可见的乙醇挥发干净。把 RNA 重溶于 100 μl 无 RNA 酶的水中。
③ 加 2 倍体积冰预冷的乙醇至小管内，将 DNA 贮存于 -70℃ 备用。
(2) 通过离心柱层析纯化 RNA
① 将 Sephadex G-50 离心柱平衡于 10 mmol/L Tris-Cl 中（pH 7.5) 灭菌处理。
② 用离心柱层析纯化 RNA。
③ 将洗脱的 RNA 贮存于 -70℃ 以备用。
(3) 通过凝胶电泳纯化 RNA
① 准备中性聚丙烯酰胺凝胶。
② 在水相中加入适当的凝胶上样缓冲液，通过凝胶电泳纯化 RNA。
③ 通过放射性自显影定位 RNA。
④ 用挤碎和浸泡的方法从凝胶块中纯化 RNA。
⑤ 将 RNA 贮存于 -70℃ 备用。
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