通过 cDNA宏阵列和基因表达谱检测 环境毒物的毒理效应实验

一.材料

1.扩增和制备克隆

（1）甘 油 保 存 的E.coli, 质 粒 含 有 目 标 cDNA 插入片段。

（2）Tag 聚合酶和缓冲液（New Englang Biolabs cat. no. M0267)。

（3）10 mmol/L dNTP 混合物。

（4）用来扩增载体中插入片段的引物稀释到 10 μmol/L (M13、 SP6、 T4 或 T7 为常用引物）。

（5）不含核酸酶的水配制的 7 0 % 乙醇。

（6）Tris-EDTA 缓冲液： 10 mmol/L T ris， lmmol/L E D TA ， pH 8.0。

（7）普通 96 孔圆底培养板。

（8）96 孔板培养用封贴（breathe easy strips， USA Scientific cat. no. 9123-6100)。

（9）L B 培养基：每 升 l0g 胰蛋白胨， 5 g 酵母提取物， 10g NaCl， pH 7.0。

（10）Milipore 过滤系统，用来纯化 PCR 产 物（MultiScreen Filtration System Vacuum Manifold cat. no. MAVM0960R 和 Montage PCR96 Cleanup plates cat. no.

MANU03010)。

（11）适用于 PCR 仪 的 96 孔 PCR 板。

（12）多道移液器（20 μL 和 200 μL)。

（13）普通平底 96 孔 或 384 孔板。

（14）进行 PCR 产物电泳的琼脂糖胶电泳系统。

（15）大小在 300〜2000 bp 之间的 DNA 分子质量标准。

（16）紫外分光光度计，最好有读板装置。

（17）紫外分光光度计可用的 96 孔 板（参照仪器说明）。

2 阵列的点印

（1）预切好的 Pall Biodyne B 中性尼龙膜（N unc， cat. no. 250385)。

（2）Spot Report Array Validation System (Stratagene， cat no. 252005-7)，包括对照 [poly (dA)、人 Cot-1、拟南芥 cDNA、空载体等], 这些对照也需要点印在阵列上。

（3）紫外透射仪（我们用的是 UV Stratalinker 1800， Stratagene)。

（4）带 96 孔板转子的离心机（任何型号均可）。

（5）自动点样仪（例如带 IOOnL 点样针的 Biomek 2000， Beckman Coulter)。

（6）蒸馏水。

（7）1 0 % 漂白剂。

（8）7 0 % 乙醇。

（9）溴酚蓝。
（10）20XSSC: 3 mol/L 氯化钠， 0.3 mol/L 柠樣酸钠， pH 7.6, 用不含核酸酶的无菌水配制。高压灭菌后置于室温。0.01 mmol/L 的溴酚蓝灭菌后加入。

3 阵列的标记、杂交和清洗

（1）M-MuLV 反转录酶和缓冲液 [New England Biolabs， cat. no. M0253S (200 U/mL)]。

（2）随机六聚引物（NewEnglandBiolabs， cat. no. S1254S) 加入 8 0 μL 不含核酸

酶的无菌水，使终浓度为 I A26。单位。

（3）10XdNTP 混合物：可以购买成品或将 100 mmol/L dCTP、 dGTP、 dTTP 各20 μL 与 10 μL 100 mmol/L dATP 混合制成。加人不含核酸酶的无菌水至总体积 400μL (终浓度为 dCTP、 dGTP、 dTTP 4 mmol/L 以及 dATP 2 mmol/L)。

（4）[α-33P] dATP: 购 买 即 可（Perkin Elmer cat. no. NEG612 H for 250 μCi)。

（5）Spike R N A 混合物：可以从 Stratagene 购买带有制备阵列所需的 spike 对照的试剂盒，也 可 以 单 独 购 买 spike RNA (Spike 2 R C A 和 Spike 3 rbcL，cat.no.252202 和 252203)。

（6）20XSSC: 3 mol/L NaCl， 0 •3 mol/L 梓樣酸钠， pH 7. 6，用不含核酸酶的无菌水配制。高压灭菌后置于室温。

（7）2 0 % SDS: 200 g 十二烧基磺酸钠加入 I L 无菌水。

（8）杂交缓冲液： 0. 375 mol/L NaCl, 0. 0375 mol/L 柠檬酸钠， 7 % SDS 和 25% 新鲜配制的甲酰胺，加入不含核酸酶的无菌水定容到 500 mL。加 人 100 m g 酵母tRNA。 4℃存放。

（9）洗 液 1: 2 XSSC-0.5%SDS(100mL20XSSC,25 mL20%SDS和 875mL 水）。

（10）洗液 2: 0.5XSSC-0.5 % SDS (25 mL 20XSSC， 25 mL 2 0 % SDS 和 950 mL水 )。

（11）10 mmol/L EDTA， pH 8. 0。

（12）去除标记反应中多余核苷的试剂盒（如 Qiagen QIAquick Nucleotide RemovalKit, cat.no.28304)。

（13）恒温金属浴。

（14）液体闪烁计数器和缓冲液。

（15）杂 交 瓶（Fisher Scientific)。

（16）杂交炉（我们用的是 Labnet 的 MaxiOven)。

4 阵列的扫描和定量

（1）透明胶片：任何办公用品商店都能买到。

（2）鱗光屏： Molecular Devices。

（3）憐光影像系统：我们用的是 Molecular Devices Typhoon Scanner。

（4）ImageQuant 软件： Molecular Devices。

方法

1 cDNA 克隆的扩增

（1）向 9 6 孔板的每个孔中加入 98 μL含适当浓度抗生素的 LB 液体培养基。

（2）向 L B 培养基中加入 2 带有目标质粒的甘油保存的菌液（每 孔 加 人 1 个克隆)。同时也应该包括一个空载体作为阵列的另一个对照（在与目标样品杂交时杂交信号应该非常弱）。

（3）用一块 breathe easy strip 覆板，盖上板盖。

（4）37°C 振荡培养过夜（转速约 125r/min)。

（5）次日上午，按每个反应 90 配制预混合的 PCR 反 应 液（ 表 1 ) ( 如果进行整板PCR，按 100 个反应配制充足的混合液)。 实验流程见图 1A 。

（6）向每孔中加人 90 混合液和 10 过夜培养的菌液。

（7）用合适的盖子覆盖 PCR 板 ，按 表 1 所述进行循环反应。

（8）反应结束后，用 1 % 的琼脂糖胶检测 PCR 产物，确认扩增结果。每个反应产物5 μL，与 DNA 分子质量标准一起上样。扩增失败的克隆需重新进行 PCR 反应。

（9）当所有的克隆扩增完毕后，将反应产物上样于 Millipore 过滤系统，使液体流过过滤膜。用 70% 乙醇洗一次。

（10）关掉真空泵，用 50 T E 缓冲液重悬 PCR 产物，于室温静置几分钟后，转移到另一个 96 孔 板 中（可以用多道移液器)。

（11）取 5 纯化后的 DNA 稀释到 95 juL 水中，用紫外分光光度计测定浓度。

（12）如果产物量不够可以重新扩增克隆，重新扩增的产物可以与第一次的合并。阵列点印需要的浓度不能低于 160 ng/ V L 。

2 阵列点印

（1）在这步开始之前，首先应该将阵列上要点印基因的位置安排好。我们往往是将基因两两重复地点上去（见注释 1)，不要忘记阵列中必须包括对照点（见注释2 和 3)。

（2）将纯化过的 DNA 稀 释 后（3000 ngDNA 加 到 18. 75μL 水中，终浓度为 160 ng/ μL 加到点印所用板的对应孔中。

（3）再向每孔中加入 1.9 μ m 3 mol/L NaOH。

（4）将板盖好，于 65°C 孵 育 15 min (我们用杂交炉孵育）。

（5）立即置于冰上，放 置 2〜3 min。

（6）短暂离心。

（7）去掉板盖，向每孔中加入含溴酚蓝的 9.35μL20XSSC，吹 打混勻（现在的体积应该约为 30 μL)。

（8）于 100 g 再次短暂离心 5 s (这一步很重要）。

（9）将上样板、尼龙膜、漂白剂、水和乙醇都装入自动点样仪后开始点样。在点样前要针对实验事先编写程序（见注释 4)。 .

（10）点另外一套样品之前（当台面上所有的阵列都点完以后），必须要先清洗点样针。设定仪器的程序，让点样针依次在漂白剂、水、乙醇中浸没 10s，风扇吹干后再进行点样。当点样针进行清洁程序时，可以将一套新的膜先准备好。

（11）用紫外透射仪对 DNA 进行交联，使之固定在膜上。照射剂量与 Southern 印迹相 同（100 mJ)。

（12）用 100 n L 的点样针可以做到高精度地点样超过 100 张膜。

3 样 品 标 记（步骤见图 IB)

（1）消除超低温冰箱中的放射性并置于有机玻璃防护后。打开 37°C 和 100°C 水浴。

（2）打开杂交炉，温度设定在 64°C , 将杂交缓冲液放人炉内进行预热。

（3）在一微量离心管中加入 2μL 随机引物、 0 •65 μL spike RNA 混合物和 2 μg 样品RNA, 加 DEPC 水至反应体积为 1 3 μL 。

（4）将离心管置于 64°C 5 min 后 ，于室温冷却 5〜10 min, 使引物退火。

（5）离心管冷却后，加 人 2 μL 10X R T 缓冲液， 2μl 10XdNTP 混合 液 ，1μL MM uLV 和 2 μL [α-33P] dATP (离心管内体积为 20 μL)。

（6）37°C 孵育 1. 5〜2 h。

（7）离心将液体甩到管底后打开离心 1。

（）用去核苷酸试剂盒纯化标记的样本。

（）取部分样本（我们取了 2 标记样本）用液体闪烁计数器测定放射强度。

4 杂交和清洗

（1）开始进行膜的预杂交。将膜放在杂交瓶中，加 入 5〜6 m L 杂 交 缓 冲 液（见注释5)，将杂交瓶放回杂交炉内，于 64°C 翻 转 （12〜1 4 r /min) 1.5〜2 h (图 2A )。

（2）计算杂交所需的放射性标记 cDNA 的 体 积（公 式 1)。每张膜都需要以同样的放射 强 度（l X 106cpm/mL) 进行杂交。

公 式 1 : 计算标记 cDNA 的量

探 针 量 = 1 000 000 cpm/mundefined V /cpm/μL

这里探针量为所需标记 cDNA 的体积，单 位 为 μL,V 表示杂交缓冲液的体积，单位为 mL。然后加人上面计算出的探针量的 2 0 倍 体 积 的 10 mmol/L EDTA

(公式 2)。

公 式 2 : 计算加入 ED TA 的量

探针量20_~L_μL加到探针中的 10 mmol/L EDTA

（3）将用公式 1 计算出体积的 cDNA 加入到用公式 2 计 算 出 的 10 mmol/L EDTA中。将二者在 1.5 m L 离心管中混合，将管盖扣紧或旋紧，以防止在变性过程中管盖松开。

（4）探针于 100°C 变 性 5 min，然后于冰上放置 2 min。

（5）2700 g 离 心 1 min 后 ，将溶液吸出转人对应的杂交瓶中，杂交瓶中此前已放入膜和杂交液。

（6）轻轻摇晃杂交瓶，然后放回杂交炉中， 64°C 旋转过夜，约 12〜15 r/min 14 h。

（7）将洗液 1 和 2 置于杂交炉中， 64°C 过夜。杂交炉内边上应该有足够的空间放置洗液。

（8）第二天上午可以开始洗膜。洗 涤过程为（图 2B):

a.首先，根据研究机构的要求将杂交液倒出后进行放射性垃圾的处理。向每个杂交瓶中加人洗液 1，确保洗液能够盖过膜的一半以上。放回杂交炉于 12〜14 r/min 翻转 30 min。

b.用洗液 1 再洗 3 次后，用洗液 2 洗 4 次（也是每次 30 min) 。 根据要求将所有废液收集进行安全处理。

c.整个过程结束应共洗膜 8 次。

（9）将膜从瓶中取出，晾干后放入突光影像暗盒中（见注释 6)。（注 ：将透明胶片放在暗盒的光栅区域，将膜与光栅排成直线，这样便于对膜的分析，见 注 释 7)。于憐屏上显影 48 h 后 ，用 typhoon scanner 扫描。

5定量

曝光后，将膜从暗盒中取出，憐屏拿去扫描信号。我们用 ImageQuant 5.1 软件包(Molecular Devices) 对样点定量。首先对影像进行对比度的调整（只用目测即可，不会影响后面的分析），然后围绕最大或信号最强的一对点（一个基因的一对点）上拉两(每个点周围一个)。其他的基因都用复制过来的同样大小的框选定，这样所有的基因都能保证背景区域大小相同。

（1）当所有的基因都框好，所有膜上的数据都收集好之后，计算每个基因对的信号均值，减去阵列上所有空白点的均值。

（2）然后，将每张膜上的基因进行均一化，使得膜与膜之间的信号具有可比性。这步可能会需要将每张膜与一个特定的均值或中值，通常为信号最强的膜，进行对比调整。

（3）然后对数据进行 log 换算，使数据更好地符合正态分布。可以咨询统计学或生物信息学专家。

（4）使用合适的统计模型和方法对实验开始前想要检测的差异进行比对。

（5）筛选到目的基因后，需要用其他方法，比如定量 PCR 进行验证。

6 统计分析和数据挖掘

在开始基因阵列实验前最重要的事情就是要考虑到如何对最终数据进行分析。包括每组处理需要的个体数，不同个体是否要进行合并，要做什么对比和做这些对比所要用的统计方法。由于阵列分析方法还在不断发展，最好在实验开始前就征询一下统计学家和生物信息学专家。同样，数据的阐述也有很多方法，这都取决于实验的类型。

1.我们一般对基因两两重复地点样，这样可以防止仪器可能出现的点样错误。

2.当对阵列上的基因进行位置排布时，一定要记得把对照放上去。我们所用的对照有一个空载体扩增产物，几个不含 D N A 的 点（只是含溴酚蓝的 20XSSC)，核糖体蛋白的 mRNA，几 种 Stratagene 的 array spot reporter 试剂盒提供的spike 和其他 cDNA。

3.由于阵列点印耗费较大，可以通过合理设计，将两个或多个阵列点印在—张膜上，从而控制实验成本。

4.现在手动点印器也可以买到，所有没有必要非得用自动点样仪，但是进行点印大量阵列时，手动仪器会比较费力而且重复性较差。真空驱动的点转印器可能也可用来点印，但是这种方法还没有人尝试过而且可能会比较费时。

5.我们一般用 5 m L 杂交缓冲液，但是具体使用体积取决于杂交瓶的体积。如果要将半张膜浸在液体中，瓶子越大所需要用的缓冲液也越多。

6.如果没有磷光影像系统的话，普通的 X 光底片也可以用_但是这种底片的动态范围比磷屏差了几个数量级，所以差异分析会相对困难。如果用底片的话，可以用光密度分析法代替 ImageQuant 或者其他憐光影像软件。

7 将膜不对称地置于磷屏上扫描，这样在扫描图像的时候可以轻易地分辨出图像所对应的膜。