Northern Blot印迹杂交​实验详细操作步骤

Northern Blot实验详细操作步骤：

1、总RNA提取。

2、变性胶的制备：取琼脂糖0.2g，加入DEPC H2O12.4 ml，加热融化，于保温状态下加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混匀、制胶。待胶凝固后，置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min。

3、样品制备：取总RNA4.5μl(约20-30μg)，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0μl、37%甲醛3.6μl、甲酰胺10μl，65℃温育15min、冰浴5min。加入EB（1μg/μl）1μl、上样缓冲液2μl。

4、电泳：上样，50V电泳（电泳时间约2hr左右）。电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察RNA的完整性，记录18S、28S条带的位置（离加样孔的距离）。

5、将RNA从变性胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜：

①按胶块大小剪取膜一张，用DEPC水中浸湿后，置于20×SSC中浸泡1hr。剪去膜一角。将胶块切去一角，并在20×SSC浸泡15min×2次。

②用长和宽均大于凝胶的一块有机玻璃板作为平台，将其放入大的干烤皿上，上面放一张Whatman 3MM滤纸，倒入20×SSC使液面略低于平台表面，当平台上方的3MM滤纸湿透后，用玻棒赶出所有气泡。

③将凝胶翻转后置于平台上湿润的3MM滤纸中央，3MM滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。

④用Parafilm膜围绕凝胶四周，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至胶上方的纸巾。

⑤在凝胶上方放置预先已浸湿的尼龙膜，排除膜与凝胶之间的气泡。

⑥将二张已湿润的、与凝胶大小相同的3MM滤纸置于膜的上方，排除滤纸与滤膜之间的气泡。

⑦将一叠（5-8cm厚）略小于3MM滤纸的纸巾置于3MM滤纸的上方，并在纸巾上方放一块玻璃，然后用一个重约500克的重物压在玻璃板上。其目的是建立液体自液池经凝胶向膜上行流路，以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在膜上。

6、使上述RNA转移持续进行15hr左右。在转膜过程中，当纸巾浸湿后，应更换新的纸巾。

7、转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸。将膜在6×SSC中浸泡5 min，以去除膜上残留的凝胶。

8、将凝胶置紫外灯下，观察胶块上有无残留的RNA。

9、膜置80℃，真空干烤1-2hr。烤干后的膜用塑料袋密封，4℃保存备用。

10、探针标记(Prime-a-Gene Labeling System,Promega公司)：

①取模板DNA 25ng于0.5ml离心管中，95-100℃变性5min，冰浴5min。

②dNTPmix的制备:取dGTP 1μl、dATP 1μl、dTTP 1μl混匀。

③将下列反应成份混合，加入上述微量离心管中：

dNTPmix 2.0μl

BSA(10mg/ml)2.0μl

5×buffer 10.0μl

Klenow酶(5u/μl)1.0μl

α-32P-dCTP 5.0μl加入适量dd H2O使反应总体积达50μl，轻轻混匀。室温下反应1hr。

11、预杂交：将膜的反面紧贴杂交瓶，加入预杂交液5ml，42℃预杂交3hr。

12、杂交：将变性的探针（95-100℃变性5min，冰浴5min）加入到预杂交液中，42℃杂交16hr。

13、洗膜：

①倒去杂交液。

②2×SSC/0.1%SDS室温洗15min。

③0.2×SSC/0.1%SDS，55℃洗15min×2次。

14、压片：将膜用ddH2O漂洗片刻，用滤纸吸去膜上水份。用薄型塑料纸将膜包好，置于暗盒中，在暗室中压上X光片。暗盒置-70℃放射自显影3～7天左右