Northern Blot印迹杂交实验介绍

Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。

Northern Blot印迹杂交的实验原理是：整合到植物染色体上的外源基因如果能正常表达，则转化植株细胞内有其转录产物——特异mRNA的生成。将提取的植物总RNA或mRNA用变性凝胶电泳分离，则不同的RNA分子将按分子质量大小依次排布在凝胶上；将他们原位转移到固定膜上；在适宜的离子强度及温度条件下，用探针与膜杂交；然后通过探针的标记性质检测出杂交体。若经杂交，样品无杂交带出现，表明外源基因已经整合到植物细胞染色体上，但在该取材部位及生理状态下该基因并未有效表达。

Northernblot的优势在于它可检测目的片段的大小、是否具有可变剪切出现、可允许探针的部分不配对性，杂交过后的膜经过一定的处理除去探针后还可保存很长时间再次杂交使用。

那么为什么northern见的比较少呢？

因为实验需要的RNA量比较大，对一些少量和痕量样品是很难实现的，因此很多实验都做反转录后的定量分析。但事实上除了无法给出realtimePCR那种量化数据外（realtimePCR，尤其是间接法的，做过的人应该有个概念吧，你标准曲线稍微偏一点点，结果就有倒过来的可能），Northern的结果才是最为直接，最可信的结果，因为cDNA的定量经过了反转录这一步，由于多了一步操作因而也多了一步不确定的因素，而且由于检测的靶由RNA调到了DNA，做PCR和杂交时结果也就会受到genomicDNA的影响（reverse-Northernblot和RT都一样），另外在杂交实验中，DNA-RNA，RNA-RNA这两种杂交双链的稳定性是比DNA-DNA稳定和严格的多的，因此不管是DNA探针还是RNA探针，检测RNA靶要比检测DNA靶在严谨性上要高很多。因此Northern Blot在材料和技术上的问题没办法做，所以在通过反转录做cDNA。