可被单一限制酶切割用作克隆载体的λ噬菌体DNA的制备实验
原理在某些情况下，制备好的 λ 噬菌体 DNA 经限制酶的简单消化即可用于克隆。但只有当所用载体能用遗传学方法筛选含有外源 DNA 序列的重组噬菌体时（如 EM
原理
在某些情况下，制备好的 λ 噬菌体 DNA 经限制酶的简单消化即可用于克隆。但只有当所用载体能用遗传学方法筛选含有外源 DNA 序列的重组噬菌体时（如 EMBL 系列、λ2001、λDASH、λZAP、λgt10），这种方案才是可行的。因为在这种情况下，不必采取步骤来减少非重组噬菌体的形成。
材料与仪器
噬菌体 T4 DNA 连接酶 带有合适缓冲液的限制性内切核酸酶
ATP 氯仿 EDTA 乙醇 酚：氯仿 乙酸钠 焦糖凝胶上样缓冲液
琼脂糖凝胶
ATP 氯仿 EDTA 乙醇 酚：氯仿 乙酸钠 焦糖凝胶上样缓冲液
琼脂糖凝胶
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
ATP ( 10 mmol/L )
氯仿
EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)
乙醇
酚：氯仿（1:1，V/V)
乙酸钠（3 mol/L，pH 7.0）（使用 pH 7.0 而不是常用的 pH 5.2 的乙酸钠非常重要。因为对在消化后用来除去缓冲液中二价阳离子的 EDTA 来说，在 pH 5.2 且浓度超过 5~10 mmol/L 时，将从溶液中沉淀出来。）
焦糖凝胶上样缓冲液（sucrose gel-loading buffer)
TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)
2. 酶和缓冲液
噬菌体 T4 DNA 连接酶
带有合适缓冲液的限制性内切核酸酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶（0.7%)，用 0.5X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭
4. 核酸和寡核苷酸
λ 噬菌体 DNA
5. 专用设备
预置于 68℃ 的水浴
6. 载体和菌株
λ 噬菌体包装混合物
二、方法
1. 将 25~50 μg λ 噬菌体 DNA 与 TE（pH 8.0）混合至终体积为 170 μl。
2. 加入 20 μl 10X 限制酶缓冲液。取两份未消化的噬菌体 DNA，每份含 0.2 μg，置于冰浴保存。
3. 加入 3 倍过量（75~150 单位）的适宜限制酶，按厂家推荐的温度消化 1 h。
4. 将反应于冰浴冷却至 0℃。再取出一 0.2 μg 的组分，将其与另一份未经消化的 DNA ( 步骤 2) 于 68℃ 温育 10 min，以打断噬菌体 DNA 黏性末端。加小量（10 μl ) 蔗糖凝胶上样缓冲液，立刻将样品加入至 0.7% 的琼脂糖凝胶中。
如果限制酶消化完全，则没有 DNA 迁移至未消化的对照电泳带处。相反，将会看到两条或更多条（依赖于载体中切割位点的数目）较小 DNA 片段。仔细査看这些小片段的数量确证不存在部分酶切产物。
这一步并不像听起来那么简单。λ 噬菌体 DNA 的左、右臂带有可互补的长为 12 碱基的末端，它们相互间可发生复性形成氢键，得到的 DNA 很容易与未切断的噬菌体 DNA 相混肴。由于这个原因，当 DNA 样品从 68℃ 水浴取出后应立即上样和进行琼脂糖电泳。
如果消化不完全，将反应加热至适宜温度，再加入限制酶（50~100 单位)，在厂家推荐的最佳温度下继续温育。
5. 当消化完全后，加入 0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0 ) 至终浓度为 5 mmol/L，用酚：氯仿和氯仿各抽提消化混合物一次。
6. 在 0.3 mol/L 乙酸钠（pH 7.0 ) 存在下，用乙醇沉淀将 DNA 从亲水相中回收回来。于 4℃ 在微量离心机中以最大转速离心 2 min 收集沉淀，用 70% 乙醇洗涤后，将 DNA 重溶于 100 μl TE ( pH 7.6 ) 中，通过测定 260 nm 的吸光率确定其浓度。
7. 取一份 0.5 μg DNA，如下所述测试其连接能力：
(1) 用水将 DNA 溶液的体积调整至 17 μl。
(2) 加入 2 μl 10X 连接缓冲液，如果必要，再加入 1 μl 10 mmol/L ATP。
有些商品化连接缓冲液中含有 ATP。如果用这样的缓冲液，就不再需要另加 ATP。
(3) 取 5 μl 步骤 (2) 中制成的混合物，冰浴保存。
(4) 在剩余的混合物（步骤(2) ) 中，加入 0.2~0.5 weiss 单位的 T4 DNA 连接酶，16℃ 温育 2 h。
(5) 用一商品化的 λ 噬菌体包装反应将 0.1 μg 的连接和未连接样品以及 0.1 μg 的未消化载体 DNA 进行包装。
1. 缓冲液和溶液
ATP ( 10 mmol/L )
氯仿
EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)
乙醇
酚：氯仿（1:1，V/V)
乙酸钠（3 mol/L，pH 7.0）（使用 pH 7.0 而不是常用的 pH 5.2 的乙酸钠非常重要。因为对在消化后用来除去缓冲液中二价阳离子的 EDTA 来说，在 pH 5.2 且浓度超过 5~10 mmol/L 时，将从溶液中沉淀出来。）
焦糖凝胶上样缓冲液（sucrose gel-loading buffer)
TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)
2. 酶和缓冲液
噬菌体 T4 DNA 连接酶
带有合适缓冲液的限制性内切核酸酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶（0.7%)，用 0.5X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭
4. 核酸和寡核苷酸
λ 噬菌体 DNA
5. 专用设备
预置于 68℃ 的水浴
6. 载体和菌株
λ 噬菌体包装混合物
二、方法
1. 将 25~50 μg λ 噬菌体 DNA 与 TE（pH 8.0）混合至终体积为 170 μl。
2. 加入 20 μl 10X 限制酶缓冲液。取两份未消化的噬菌体 DNA，每份含 0.2 μg，置于冰浴保存。
3. 加入 3 倍过量（75~150 单位）的适宜限制酶，按厂家推荐的温度消化 1 h。
4. 将反应于冰浴冷却至 0℃。再取出一 0.2 μg 的组分，将其与另一份未经消化的 DNA ( 步骤 2) 于 68℃ 温育 10 min，以打断噬菌体 DNA 黏性末端。加小量（10 μl ) 蔗糖凝胶上样缓冲液，立刻将样品加入至 0.7% 的琼脂糖凝胶中。
如果限制酶消化完全，则没有 DNA 迁移至未消化的对照电泳带处。相反，将会看到两条或更多条（依赖于载体中切割位点的数目）较小 DNA 片段。仔细査看这些小片段的数量确证不存在部分酶切产物。
这一步并不像听起来那么简单。λ 噬菌体 DNA 的左、右臂带有可互补的长为 12 碱基的末端，它们相互间可发生复性形成氢键，得到的 DNA 很容易与未切断的噬菌体 DNA 相混肴。由于这个原因，当 DNA 样品从 68℃ 水浴取出后应立即上样和进行琼脂糖电泳。
如果消化不完全，将反应加热至适宜温度，再加入限制酶（50~100 单位)，在厂家推荐的最佳温度下继续温育。
5. 当消化完全后，加入 0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0 ) 至终浓度为 5 mmol/L，用酚：氯仿和氯仿各抽提消化混合物一次。
6. 在 0.3 mol/L 乙酸钠（pH 7.0 ) 存在下，用乙醇沉淀将 DNA 从亲水相中回收回来。于 4℃ 在微量离心机中以最大转速离心 2 min 收集沉淀，用 70% 乙醇洗涤后，将 DNA 重溶于 100 μl TE ( pH 7.6 ) 中，通过测定 260 nm 的吸光率确定其浓度。
7. 取一份 0.5 μg DNA，如下所述测试其连接能力：
(1) 用水将 DNA 溶液的体积调整至 17 μl。
(2) 加入 2 μl 10X 连接缓冲液，如果必要，再加入 1 μl 10 mmol/L ATP。
有些商品化连接缓冲液中含有 ATP。如果用这样的缓冲液，就不再需要另加 ATP。
(3) 取 5 μl 步骤 (2) 中制成的混合物，冰浴保存。
(4) 在剩余的混合物（步骤(2) ) 中，加入 0.2~0.5 weiss 单位的 T4 DNA 连接酶，16℃ 温育 2 h。
(5) 用一商品化的 λ 噬菌体包装反应将 0.1 μg 的连接和未连接样品以及 0.1 μg 的未消化载体 DNA 进行包装。
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