DNA 测序（Maxam-Gilbert化学修饰法）

一、取待测DNA片段，既可以是单链也可以是双链。

化学降解法测序首先要制备单侧末端标记的待测DNA片段。DNA片段的核素标记有三种方法：

1.  利用T4噬菌体多核苷酸激酶和γ-32P-ATP标记DNA的5-末端 对于去5′-磷酸化的DNA片段，T4噬菌体多核苷酸激酶可以通过正向反应将γ-32P-ATP的γ-磷酸基转移至DNA的5-末端；对于5'-磷酸化的DNA片段，在过量ATP条件下，该酶可以通过交换反应将γ-32P-ATP的γ-磷酸基与DNA的5-末端磷酸基发生交换反应而标记。但对于双链DNA片段，由于DNA的两侧均被标记，不能直接用于测序反应。需要经限制性内切酶切割，电泳分离二种不同大小的标记片段，或者直接用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离二条单链，但这种分离方法比较困难，较少使用。

2.  利用末端转移酶和α-32P-ddNTP标记DNA的3-末端 在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加入DNA分子的3-羟基末端，如果作为底物的核苷酸经过修饰（如ddNTP），则可以在DNA的3-OH上仅加入一个核苷酸。对于双链DNA片段，亦存在DNA的两侧均被标记问题，可通过上述同样的方法分离。

3.  利用Klenow片段和α-32P-dNTP对限制性内切酶产生的3-凹进末端进行标记 这种方法能直接制备单侧末端标记的DNA，但要求待测DNA能满足下列条件之一：①DNA两端的一侧为3-凹进末端，而另一侧为平端或3-凸出末端；②两端虽均为3-凹进末端但末端单链结构不同，这时可选择不同的γ-32P-NTP来实现末端标记。这是对双链DNA进行不对称标记的常用方法，如图7-4-4所示。

CS载体系列（CS是chemical sequecing的缩写）是专门为化学降解法测序进行末端标记而构建的一类克隆载体，如pSP64CS和pSP65CS。这类载体最重要的特点是，在待测DNA克隆片段的附近有两个可被限制性酶Tth111识别的典型位点（GACN↓NNGTC，不对称），能在克隆DNA片段两侧不同的3-凹进末端，从而方便地实现对待测DNA的单侧标记。

值得特别注意的是，化学降解法对标记的待测DNA纯度有较高的要求，因为盐浓度会干扰肼对胸腺嘧啶的修饰，也会抑制A+G反应中的去嘌呤过程。因此，标记的DNA一般要经酚/氯仿抽提、70%乙醇洗涤除盐，并用去离子水溶解而不用TE缓冲液。

在化学降解法中，专门用来对核苷酸作化学修饰并打开碱基环的化学试剂主要有肼（hydrazine）和二硫酸甲酯（dimethylsulphate）。

肼又叫联氨（NH2-NH2），在碱性条件下，能作用于T/C的C4和/或C6原子位置，并同C4-C5- C6环化形成一种新的五元环。肼进一步作用释放出吡唑啉酮环。在六氢吡啶的作用下，通过β消除反应，该碱基两端的磷酸基团便会以磷酸分子形式从糖环上释放出来，从而导致在这个核苷酸位置上发生DNA断裂如果在此反应体系中加入1mol/L浓度的盐，则肼同T的反应速率会下降，便可发生C特异的化学切割反应。因此，可以根据这一特点来区别C和C+T这2种化学切割反应。化学反应过程如图7-21所示。

二硫酸甲酯[(CH3O)2SO2]，能使DNA碱基环中的氮原子发生甲基化反应。在DNA测序分析中所涉及的甲基化位点是G的N7原子和A的N3原子。在中性pH环境中，这2种碱基的甲基化作用，都足以导致其糖苷键发生水解作用，而留下失去碱基的糖-磷酸骨架。再通过碱催化的β-消除反应水解无碱基糖环两端的磷酸二酯键，造成DNA在此位点发生断裂。同时，已知DNA中G的N7原子甲基化速率比A的N3原子快4~10倍，故在中性条件下水解速率G位置也比A位置要快得多（差4~6倍），这是早期Maxam-Gilbert化学降解法测序辨别DNA中G和A的基本依据。现行的化学裂解反应，都采用六氢吡啶与DNA中的甲基化碱基反应，且这种反应对甲基化的G是特异的，因此这种DNA链的断裂也仅发生在G残基位点。化学反应过程如图7-22所示。

化学反应设有5组独立的反应：G反应（在G 残基上的裂解）、A+G反应（在嘌呤残基上的裂解）、C+T反应（在嘧啶残基上的裂解）、C反应（在C残基上的裂解）和A＞C反应（在A和C 残基上的裂解），A＞C反应也可以不做。

对于测序电泳图谱的识读，化学降解法测序要比末端终止法较为复杂，因为化学裂解反应并非是完全绝对碱基特异的。每组测序图谱为5条或4条（A＞C反应可以不做）泳道。需要通过从C+T泳道出现的条带中扣除C泳道的条带而推断T残基的存在。类似地，A残基的位置也要通过从A+G泳道中扣除G泳道的条带推断出来。同时，如果A＞C泳道中出现较强的条带，则可确证A残基的存在。

实际读片时从胶片底部一个个地向顶部读取。从下至上，一个一个地从G+A泳道和C+T泳道二个列中确定只相差一个碱基的条带。如果在G+A泳道中出现一条带，就看G泳道中是否有相同大小的带，如果有即为G碱基，如果没有则为A碱基；同样，在C+T泳道中出现的条带，就检查C泳道中有无同样大小的条带，如果有即为C，无则为T。如果做了A＞C反应，在该列中出现较强的条带时，可帮助A的确定。

在化学降解法与链终止法问世之初，利用化学降解法进行测序不仅重复性更高，而且由于只需要简单的化学试剂和一般的实验条件，易为普通实验室和研究人员所掌握。而链终止法需要单链模板、特异的寡核苷酸引物和高质量的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段），这在二十世纪八十年代一般的实验室很难做到。但随着M13mp载体的发展、DNA合成技术的进步及Sanger法测序反应的不断完善，至今DNA测序已大都采用Sanger法进行。然而，Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析DNA甲基化修饰情况，还可以通过化学保护及修饰等干扰实验来研究DNA的二级结构和DNA与蛋白质的相互作用，这些仍然是Maxam-Gilbert法所独具的鲜明特点。

当然，如同双脱氧终止法一样，化学降解法测序的主要限制因素也是测序凝胶的分辨能力。化学测序法一般都用32P标记，所以与用32S标记作标记的末端终止法相比，它显示的条带较宽且有扩散现象，这限制了化学降解法在对较大DNA片段测序时的分辨能力。一般一块电泳胶上最多能读出200~250核苷酸序列。然而，如果按2个相反的取向分别从DNA片段的两端进行测序，则可克服这一不足。