谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白实验
材料与仪器表达 GST 融合蛋白的大肠杆菌细胞二硫苏糖醇 谷胱甘肽洗脱缓冲液 磷酸缓冲钠盐溶液 TritonX-100 DNase 溶菌酶 RNase 凝血酶、
材料与仪器
表达 GST 融合蛋白的大肠杆菌细胞
二硫苏糖醇 谷胱甘肽洗脱缓冲液 磷酸缓冲钠盐溶液 TritonX-100 DNase 溶菌酶 RNase 凝血酶、肠激酶或 Xa 因子溶液 SDS-聚丙烯酰胺凝胶
SorvallSS-34 转头或相当的转头 谷胱甘肽-琼脂糖树脂 皮下注射针头
二硫苏糖醇 谷胱甘肽洗脱缓冲液 磷酸缓冲钠盐溶液 TritonX-100 DNase 溶菌酶 RNase 凝血酶、肠激酶或 Xa 因子溶液 SDS-聚丙烯酰胺凝胶
SorvallSS-34 转头或相当的转头 谷胱甘肽-琼脂糖树脂 皮下注射针头
步骤
材料
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的成分参见附录 1。
贮存液稀释至适当浓度。
二硫苏糖醇（1mol/L)
谷胱甘肽洗脱缓冲液
10mmol/L 还原型谷胱甘肽
50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
磷酸缓冲钠盐溶液（PBS)(4°C)
TritonX-100(0.2%V/V)
酶和缓冲液
DNase(5 mg/ml)
溶菌酶
RNase(5 mg/ml)
凝血酶、肠激酶或 Xa 因子溶液
溶液的配制和贮存参照生产商手册。
凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%)
用于分离蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备请参考附录 8。
离心机和转头
SorvallSS-34 转头或相当的转头
特别配备
谷胱甘肽-琼脂糖树脂
必要时用 20% 乙醇将树脂调成 50% 匀浆。
皮下注射针头（18#22#和 25#)
载体和细菌菌株
表达 GST 融合蛋白的大肠杆菌细胞（方案 1 或 2 的步骤 17 所制备的细胞沉淀）。
方法
谷胱甘肽-琼脂糖树脂的处理
1. 轻轻顛倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆。
2. 取部分匀浆放入 15 ml 聚丙烯管（每 100 ml 细菌培养物需要 2 ml 匀浆)。
3.4°C500 g(2100r/min Sorvall SS-34 转头）离心 5 min, 小心去掉上清。
4. 在树脂中加入 10 倍柱床体积的冷的 PBS, 顛倒数次，混合均匀，4°C 500 g(2100r/min SorvallSS-34 转头）离心 5 min, 小心去掉上清。
5. 每毫升树脂加入 lml 冷的 PBS, 制成 50% 匀浆，顛倒数次，混合均匀，悬液冰上放置待用。
制备细胞抽提物
6. 每 100 ml 培养物的细胞沉淀（方案 1 步骤 17) 悬于 4 mlPBS。
7. 加入溶菌酶至终浓度 1 mg/ml, 冰上放置 30 min。
有些方案中在亲和纯化 GST 融合蛋白之前，采用超声或弗氏压碎的方法裂解细胞。使用溶菌酶的方法重复性更好，而且不会引起细胞的灾难性裂解. 后者释放外膜蛋白和能引起 GST 融合蛋白聚集或者能与其共纯化的其他分子。
8. 用针筒将 10 ml 0.2% TritonX-100 强行注入黏的细胞裂解物中，剧烈振动数次混匀。
加入 DNase 和 RNase 至终浓度 5ug/ml,4°C 振动溫育 10 min。3000 g(5000r/min Sorvall SS-34 转头）离心 30 min, 去除不溶性细胞碎片。上清（细胞裂解物）转移到一只新管中，加入 DTT 至终浓度 lmmol/L。
为防止纯化过程中树脂被堵寒，上清液需要用 0.45um 滤膜过滤。
加人 TritonX-100 的目的是防止蛋白聚集。能溶解融合蛋白又不干扰谷胱甘肽-琼脂糖亲和纯化的变性剂有 1%(V/V）TritonX-lOO, 含 10 mmol/L DTT 的 1%(WV)Tween-20,0.03%(m/V)SDS 和 1.5%(m/V) 十二烧基肌氨酸（Smith and Johnson1988;Frankel et al.1991;Grieco et al,1992)。加入 Tween-20、SDS 和 N-十二烷基肌氨酸可以替代 TritonX-100 或与其共同作用。请参考疑难解析：不溶性蛋白。
纯化融合蛋白
9. 细胞裂解物与适量 50% 谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混和，每 100 ml 细菌培养物加 2 ml 树脂，于室温轻摇 30 min。
10. 混合物于 4°C 以 500 g(2100r/min SorvallSS-34 转头）离心 5 min, 小心去掉上清并留样少许进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳。
11. 沉淀中加入 10 倍柱床体积的 PBS, 顛倒离心管数次混勻，洗去未与树脂结合的蛋白。
12.4°C 以 500 g（2100r/min SorvallSS-34 转头）离心 5 min, 小心去掉上清并留样少许进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳。
13. 重复步骤 11 和 12 两次
14. 结合的 GST 融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用凝血酶、肠激酶或 Xa 因子切割，释放靶蛋白。
用谷胱甘肽洗脱融合蛋白
a. 沉淀中加入 1 倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻揽动 10 min, 洗脱树脂上结合的蛋白。
b. 如步骤 12 离心，上清（含洗脱的融合蛋白）移至新管中。
c. 重复步骤 a 和 b 两次，合并 3 次的上清。
经过上述洗脱步骤后，有些蛋白可能还会有大量的仍结合在树脂上，有时可能需要进一歩洗脱. 而且蛋白不同洗脱体积和时间也应有所区别。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以监测洗脱液中 GST 融合蛋白含量。对于 GST 融合蛋白，一般情况是 1A280=0.5 mg/ml, 测定 280mn 吸收可以估算融合蛋白的产量，也可以采用标准的生色法（Lowry or Bradford) 测定融合蛋白的产量，如果采用 Lowry 法，样品必须先用 2000 倍体积的 1XPBS 透析，去除谷胱甘肽，否则的话会干扰测定，而 Bradford 法不受谷胱甘肽的影响。
蛋白酶解从结合的 GST 融合蛋白上回收靶蛋白
a. 在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶、肠激酶或 Xa 因子（根据融合蛋白中的位点选择)。每毫升树脂加入 50 单位溶于 lmlPBS 的蛋白酶。颠倒离心管数次混勻，室温下振荡 2~16 h。用小规模试验确定精确时间。
b.4°C 以 500 g（2100r/min Sorvall SS-34 转头）离心 5 min, 上清小心转移到新管中。
GST 仍结合在树脂上，而靶蛋白在上清中，蛋白酶也在上清中。用传统的层析方法或 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离白和蛋白酶。
15.10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析每一步（细胞抽提、洗涤和洗脱）样品的蛋白质组成。
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的成分参见附录 1。
贮存液稀释至适当浓度。
二硫苏糖醇（1mol/L)
谷胱甘肽洗脱缓冲液
10mmol/L 还原型谷胱甘肽
50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
磷酸缓冲钠盐溶液（PBS)(4°C)
TritonX-100(0.2%V/V)
酶和缓冲液
DNase(5 mg/ml)
溶菌酶
RNase(5 mg/ml)
凝血酶、肠激酶或 Xa 因子溶液
溶液的配制和贮存参照生产商手册。
凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%)
用于分离蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备请参考附录 8。
离心机和转头
SorvallSS-34 转头或相当的转头
特别配备
谷胱甘肽-琼脂糖树脂
必要时用 20% 乙醇将树脂调成 50% 匀浆。
皮下注射针头（18#22#和 25#)
载体和细菌菌株
表达 GST 融合蛋白的大肠杆菌细胞（方案 1 或 2 的步骤 17 所制备的细胞沉淀）。
方法
谷胱甘肽-琼脂糖树脂的处理
1. 轻轻顛倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆。
2. 取部分匀浆放入 15 ml 聚丙烯管（每 100 ml 细菌培养物需要 2 ml 匀浆)。
3.4°C500 g(2100r/min Sorvall SS-34 转头）离心 5 min, 小心去掉上清。
4. 在树脂中加入 10 倍柱床体积的冷的 PBS, 顛倒数次，混合均匀，4°C 500 g(2100r/min SorvallSS-34 转头）离心 5 min, 小心去掉上清。
5. 每毫升树脂加入 lml 冷的 PBS, 制成 50% 匀浆，顛倒数次，混合均匀，悬液冰上放置待用。
制备细胞抽提物
6. 每 100 ml 培养物的细胞沉淀（方案 1 步骤 17) 悬于 4 mlPBS。
7. 加入溶菌酶至终浓度 1 mg/ml, 冰上放置 30 min。
有些方案中在亲和纯化 GST 融合蛋白之前，采用超声或弗氏压碎的方法裂解细胞。使用溶菌酶的方法重复性更好，而且不会引起细胞的灾难性裂解. 后者释放外膜蛋白和能引起 GST 融合蛋白聚集或者能与其共纯化的其他分子。
8. 用针筒将 10 ml 0.2% TritonX-100 强行注入黏的细胞裂解物中，剧烈振动数次混匀。
加入 DNase 和 RNase 至终浓度 5ug/ml,4°C 振动溫育 10 min。3000 g(5000r/min Sorvall SS-34 转头）离心 30 min, 去除不溶性细胞碎片。上清（细胞裂解物）转移到一只新管中，加入 DTT 至终浓度 lmmol/L。
为防止纯化过程中树脂被堵寒，上清液需要用 0.45um 滤膜过滤。
加人 TritonX-100 的目的是防止蛋白聚集。能溶解融合蛋白又不干扰谷胱甘肽-琼脂糖亲和纯化的变性剂有 1%(V/V）TritonX-lOO, 含 10 mmol/L DTT 的 1%(WV)Tween-20,0.03%(m/V)SDS 和 1.5%(m/V) 十二烧基肌氨酸（Smith and Johnson1988;Frankel et al.1991;Grieco et al,1992)。加入 Tween-20、SDS 和 N-十二烷基肌氨酸可以替代 TritonX-100 或与其共同作用。请参考疑难解析：不溶性蛋白。
纯化融合蛋白
9. 细胞裂解物与适量 50% 谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混和，每 100 ml 细菌培养物加 2 ml 树脂，于室温轻摇 30 min。
10. 混合物于 4°C 以 500 g(2100r/min SorvallSS-34 转头）离心 5 min, 小心去掉上清并留样少许进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳。
11. 沉淀中加入 10 倍柱床体积的 PBS, 顛倒离心管数次混勻，洗去未与树脂结合的蛋白。
12.4°C 以 500 g（2100r/min SorvallSS-34 转头）离心 5 min, 小心去掉上清并留样少许进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳。
13. 重复步骤 11 和 12 两次
14. 结合的 GST 融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用凝血酶、肠激酶或 Xa 因子切割，释放靶蛋白。
用谷胱甘肽洗脱融合蛋白
a. 沉淀中加入 1 倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻揽动 10 min, 洗脱树脂上结合的蛋白。
b. 如步骤 12 离心，上清（含洗脱的融合蛋白）移至新管中。
c. 重复步骤 a 和 b 两次，合并 3 次的上清。
经过上述洗脱步骤后，有些蛋白可能还会有大量的仍结合在树脂上，有时可能需要进一歩洗脱. 而且蛋白不同洗脱体积和时间也应有所区别。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以监测洗脱液中 GST 融合蛋白含量。对于 GST 融合蛋白，一般情况是 1A280=0.5 mg/ml, 测定 280mn 吸收可以估算融合蛋白的产量，也可以采用标准的生色法（Lowry or Bradford) 测定融合蛋白的产量，如果采用 Lowry 法，样品必须先用 2000 倍体积的 1XPBS 透析，去除谷胱甘肽，否则的话会干扰测定，而 Bradford 法不受谷胱甘肽的影响。
蛋白酶解从结合的 GST 融合蛋白上回收靶蛋白
a. 在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶、肠激酶或 Xa 因子（根据融合蛋白中的位点选择)。每毫升树脂加入 50 单位溶于 lmlPBS 的蛋白酶。颠倒离心管数次混勻，室温下振荡 2~16 h。用小规模试验确定精确时间。
b.4°C 以 500 g（2100r/min Sorvall SS-34 转头）离心 5 min, 上清小心转移到新管中。
GST 仍结合在树脂上，而靶蛋白在上清中，蛋白酶也在上清中。用传统的层析方法或 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离白和蛋白酶。
15.10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析每一步（细胞抽提、洗涤和洗脱）样品的蛋白质组成。
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