噬菌体文库的铺平板和转移实验基本方案

1.  通过系列等比稀释滴定噬菌体文库的滴度。

 

2.  重组噬菌体与铺平板的宿主菌混合于培养试管中（表一），于37 ℃温育20 min。
 

表一、噬菌体文库铺平板组分最佳配制方法

 

3.  按每个平板的噬菌体数决定筛选文库时将用到的平板数。

4.  该数目取决于文库中重组噬菌体的数目和目的克隆出现的概率。

5.  在试管中加入0.7%顶层琼脂糖，并迅速倾倒在37 ℃保温的LB上平板上，37℃培养约6~12 h，至噬斑布满平板，但大小适当互不相连。

6.  平板置于4℃1 h以上方可用于滤膜影印实验。

 

7.  用原珠笔在硝酸纤维滤膜上做好标记，标记面朝上。

8.  将滤膜覆盖在预冷的长有噬斑的LB平板上1~10 min 用20-G针头穿刺标明定位方向后。

9.  用平头镊子取出滤膜，面朝上轻放在纸巾或滤纸上，室温晾干10 min 以上。

 

10.  接着，滤膜转印面朝上，依次放在3张分别饱蘸下面3种液体的Whatman 3 MM 滤纸上，各1~2 min。

（1）0.2 mol/l NaOH / 1.5mol/l NaCl

（2）0.4 mol/l Tris·Cl pH7.6 / 2×SSC

（3）2×SSC

 

10.  将滤膜置于真空烤箱中80℃干烤90~120 min，或者置于42℃的恒温箱中过夜，若暂不做杂交实验，滤膜可用干燥的滤纸夹好，室温保存。