阿司匹林对人γδT细胞杀伤消化系统肿瘤细胞的影响

[摘要]

目的 探讨阿司匹林对人γδT细胞杀伤消化道肿瘤细胞株的影响。

方法 用异戊烯焦磷酸法体外扩增人外周血γδT细胞。用不同浓度的阿司匹林诱导γδT细胞和消化道肿瘤SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116、LOVO细胞株，用MTT法检测阿司匹林对这些细胞的抑制率和用乳酸脱氢酶法测定γδT细胞的杀伤活性，用流式细胞术检测诱导前后的γδT细胞和SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞凋亡百分率。

结果 γδT细胞培养10天时从扩增前4.21%增加到70.35%，CD44达94.0%。阿司匹林在3.2mmol/L时对γδT细胞的生长抑制率达41.3%，明显高于对SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞株抑制率（分别为19.6%、11.8%、9.2%、6.4%和%1.6）。0.4 mmol/L～1.6 mmol/L阿司匹林诱导24h后的γδT细胞对5种肿瘤细胞的杀伤活性最高，浓度超过3.2 mmol/L时杀伤活性呈下降趋势； SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞经不同浓度的阿司匹林诱导24h后γδT细胞对其的杀伤活性除SW-1116和LOVO细胞株略有增强外，其他组与对照组比较无明显变化。3.2 mmol/L阿司匹林对γδT细胞诱导24h的凋亡率（52.71%）显著高于SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞株(分别为7.88%、8.89%、6.21%、4.47%和%3.67)。

结论 阿司匹林在临床常规使用的药物浓度时可增强γδT细胞杀伤肿瘤细胞作用，超过这一浓度可明显抑制γδT细胞的增殖能力和杀伤活性及增加γδT细胞的凋亡率，而对SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞株作用不明显。这一结果为临床阿司匹林预防消化道肿瘤的用量提供了实验依据。

[关键词] γδT细胞，培养；阿司匹林；人消化系统肿瘤SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞株

[Abstract] Objective To explore the effect of aspirin on human’s γδT cells killing digestive system tumor cell lines methods Use the isopentenyl pyrophosphate method to amplify human peripheral blood γδT cells in vitro. Various concentrations of aspirin were used to induce γδT cells and digestive system tumor cells SGC-7901,SW-1990,SW-480, SW-1116 , LOVO cells lines, MTT assays was used to detect aspirin on the inhibitory ratio of these cell lines, LDH assays was used to measure the cytotoxic activity of γδT cells , flow cytometry analysis the apoptosis percentage of before and after induced γδT cells and SGC-7901,SW-1990,SW-480, SW-1116 ,LOVO cell lines. Result γδT cells were cultivated for ten days which proliferation ratio increase from 4.21% to 70.35%,CD44 is up to 94.0%. When aspirin ´s concentrations was 3.2 mmol/L that γδT cells growth inhibitory ratio for 41.3% and which obvious higher than SGC-7901, SW-1990, SW-480, SW-1116, LOVO cell lines (respectively 19.6% 11.8% 9.2% 6.4% 1.6%). When γδT cells iduced via aspirin concentrations rang from 0.4mmol/L to 1.6 mmol/L which cytotoxic activity on the five kinds of tumor cell lines was the highest , if aspirin’s concentration surpassing 3.2mmol/L，cytotoxic activity of γδT cells present decrease tendency. SGC-7901, SW-1990, SW-480, SW-1116, LOVO cells lines were induced by different concentrations of aspirin for 24 hours, just SW-1116 and LOVO were enhanced as far as the cytotoxic activity of γδT cells on these cell lines was concerned ,other groups and control group have no notable changed. The apoptosis percentage of γδT cells(52.71%) were induced by aspirin which concentration was 3.2mmol/L ,which is strikingly higher than SGC-7901, SW-1990, SW-480, SW-1116, LOVO cells lines,(respectively 7.88%, 8.89%, 6.21%, 4.47% and 3.67%). Conclusion When aspirin ´s concentration for clinical routine used can enhance the effect of γδT cells killing the tumor cells, if surpassing this concentration can obvious inhibited the proliferation capacity and cytotoxic activity

f γδT cells and augment apoptosis ratio ,however, it is not obvious for digestive tract tumor lines. This result may offer an experiment base for applying clinical aspirin to prevent digestive tract’s tumor.

[Key words] γδT cells, cultivation, Aspirin, GC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116 and LOVO digestive system tumor cell lines

γδT细胞是广泛分布于消化系统、呼吸系统等粘膜和上皮组织内的固有免疫T细胞，它的抗肿瘤效应除了有与αβT细胞类似的一些功能特征外，还有识别抗原不需要MHC分子提呈、直接识别蛋白质和肽类抗原、非肽类抗原，具有抗原提呈功能和能通过细胞接触和分泌的细胞因子起免疫调节作用[1]。

流行病学调查发现，长期服用非甾体类抗炎药能减少和预防消化道肿瘤的发生[2]，阿司匹林是非甾体抗炎药物的代表。为此，本实验用不同浓度的阿司匹林对人γδT细胞和5株消化系统肿瘤细胞株进行细胞抑制、细胞凋亡和γδT细胞杀伤活性的对比试验，以探讨阿司匹林是否对γδT细胞有调节作用和对人γδT细胞杀伤肿瘤细胞的影响。

1.材料与方法

1.1 材料 人胃腺癌细胞株SGC-7901，人胰腺癌细胞株SW-1990，人结肠癌细胞株SW-480、SW-1116和LOVO（上海细胞生物研究所）；胰蛋白酶、RPMI1640（Gibco公司产品）；人AB血清（徐州市血站）；胎牛血清和淋巴细胞分离液（中国科学院血液病研究所）；

异戊烯焦磷酸(isopentenylpgrophosphate.IPP)、阿司匹林、四甲基偶唑篮(MTT)、二甲亚砜(DMS0)、PI染液（Sigma公司）；

IL-2（厦门特宝生物公司）；抗人TCR-γδ-FITC和抗人CD44-FITC均购自杭州联科生物（Immunotech, France）；SEAC全自动酶免系列分析仪(北京希亚克技术有限公司)；流式细胞仪(美国B.D公司的FACSCaliar)，分析软件为CellQuest,每个标本分析细胞数≥1×104。

1.2 方法

1.2.1 γδT细胞的培养和鉴定 取健康献血者末梢抗凝血10mL,加入淋巴细胞分离液上，以2000r/min离心15min，吸取单个核细胞层，用生理盐水洗涤三遍（1500r/min离心，10min/次），加入RPMI 1640培养液中（含100/L小牛血清、50/L人AB血清和IPP 3mg/L），调整细胞数为1×108/L，置75㎝2细胞培养瓶中，于37℃、50mL/L CO2培养箱中培养，根据细胞生长情况及时添加培养液。收集培养10d的贴壁生长细胞进行细胞表面标志检测和其他试验。

1.2.2 阿司匹林对消化系统肿瘤细胞株和γδT细胞生长的影响 将培养10d的γδT细胞和对数生长期的五种肿瘤细胞株配成1×109/L，分别接种于96孔板中，0.2mL/孔，于37℃、50mL/L CO2培养箱中培养，24h后加入阿司匹林(终浓度分别为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L、1.6mmol/L、3.2mmol/L、6.4mmol/L、12.8mmol/L和25.6mmol/L)；设不加药物及无细胞的空白对照孔。

继续孵育24h后每孔加人MTT液20μl，37℃孵育4h后弃上清，每孔加入DMSO 150μL，轻轻震荡10min使甲瓒充分溶解，在540nm波长酶标仪上测定各孔光吸收值(OD值)，求其平均值；同时计算细胞抑制率。

1.2.3 γδT细胞和消化系统肿瘤细胞株凋亡检测 取培养10d的γδT细胞和对数生长期SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞以每孔2×1O5个细胞接种于24孔板，用阿司匹林((终浓度分别为0.2mmol/L、0.8mmol/L、3.2mmol/L、12.8mmol/L和25.6mmol/L))诱导，每组设3个复孔。

细胞经药物诱导24h后弃上清，SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，γδT细胞直接收集，用RPMI 1640培养基洗涤3遍，加入70%冷乙醇固定，4℃过夜。PBS洗涤3次，加入PI染液(生理盐水 129.6mL，PI 10mg，RNA酶2mg，TritonX-100 1mL，枸橼酸钠200mg，加双蒸水至200mL)，4℃避光染色30min，用FCM检测，记录激发波长488nm处的红色荧光。