采用PACE分析RNA-肽相互作用实验
原理聚丙烯酰胺共电泳（poiyacrylamide coelectrophuresis，PACE ) 检测是相对较晚发展起来的定量分析蛋白质、肽与 DNA 或
原理
聚丙烯酰胺共电泳（poiyacrylamide coelectrophuresis，PACE ) 检测是相对较晚发展起来的定量分析蛋白质、肽与 DNA 或 RNA 相互作用的方法。
材料与仪器
低放射性标记物 RNA 底物
TBE 凝胶储存缓冲液 电泳缓冲液 丙烯酰胺储存液 过硫酸铵 考马斯亮蓝
聚丙烯酰胺凝胶电泳设备 PACE 凝胶 层析纸 塑料膜 凝胶干燥器 暗盒
TBE 凝胶储存缓冲液 电泳缓冲液 丙烯酰胺储存液 过硫酸铵 考马斯亮蓝
聚丙烯酰胺凝胶电泳设备 PACE 凝胶 层析纸 塑料膜 凝胶干燥器 暗盒
步骤
一、材料与设备
1. 标准聚丙烯酰胺凝胶电泳设备，包括电源、电泳槽、夹子、热槽（1/8 英寸厚的铝板）。
2. 宽而短的凝胶，因为宽的凝胶可以包含更多的浓度梯度，短的凝胶可以减少每个聚丙烯酰胺条需要的肽量，一般尺寸为 24 cm X 36 cm 或 26 cm X 36 cm( h X w )，凝胶的实际尺寸并不是至关重要的，在具体应用时这个操作程序同样可以在其他尺寸的凝胶应用。
3. 针对 PACE 凝胶，梳子和垫片要进行一定的切割，如图 11.5 所描述对梳子和垫片进行切割，切割以后的凝胶可以包括 10 个肽浓度。
4. 10 ml Luer 注射器，25 gage 针头，手套和石蜡膜。
5. 低放射性标记物。
6. 层析纸，塑料膜和凝胶干燥器。
7. 暗盒，X 射线片和显影剂。
8. 放射物质定量仪器。
9. 5X TBE 凝胶储存缓冲液和电泳缓冲液：450 mmol/L Tris 碱，450 mmol/L 硼酸，10 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
10. 40% 丙烯酰胺储存液（29：1，丙烯酰胺：甲叉甲双丙烯酰胺）。
11. 10% 过硫酸铵（API 水溶液（m/V），99% TEMED。
12. 32P 标记的 RNA 底物，PACE 可以使用 3'，5' 或者内部标记的 RNA。可以采用标准的程序制备 RNA 样品，如果仅有痕量浓度的 RNA 上样到 PACE 凝胶，则要求高的放射活性（> 200 dμm/fmol）。
13. 制备并纯化肽或者蛋白。因为 PACE 测定非常敏感，高纯度和精确浓度的肽是最基本的要求，一般采用反向高效液相色谱（PR-HPLC）或其他的高精度的纯化方法进行纯化，蛋白或肽溶液要用水或合适的储存缓冲液进行系列稀释。储存液通常配制为 100X，在使用时稀释 100 倍。
14. RNA 样品稀释到 6X 的 Ⅲ 型上样染料中：0.24% 溴酚蓝，0.24% 的二甲苯青 FF，30% 的甘油水溶液。
15. 考马斯亮蓝蛋白染色：0.24% 考马斯亮蓝，45% 甲酵的 10% 冰醋酸水溶液，用来标定 PACE 电泳的时间。
二、试验方法
1. 检测
(1) 用去污剂仔细清洗每个凝胶板并用水冲干净，然后再用乙醇淋洗，理想硅化板可以保证灌注后凝胶混合物均匀分布。如图 11.6 所示安装凝胶板、梳子和垫片，将其旋转 90°。滑动取出上部的垫片（S）创造一个灌胶的空隙，在 B 和 P 相对的毎个缺口的顶部之间画线，标定每个肽浓度凝胶的灌注高度，标记每个道并记录所使用的肽储存液浓度。
(2) 制备 200 ml 凝胶混合物：0.5X TBE，15% ( 29：1）丙烯酰胺，0.02% 的过硫酸铵（20 ml 5X TBE 储存液，75 ml 40% 的丙烯酰胺储疗液，400 μl 10% 的 AP，104.6 ml 重蒸水）。使用时添加盐（Na+，K+，Mg2+ 等）、去污剂或其他缓冲液成分到合适的终浓度。为了快速完全聚合，使用真空抽气机进行脱气，直到不强烈的产生气泡。如果使用去污剂，要在脱气以后加入，凝胶混合物终体积为 200 ml。
(3) 去除注射器的活塞，用石蜡膜封住针筒下部的孔并保持竖直，加入 70.7 μl 100X 肽储存液（或缓冲液，在肽浓度为 0 的凝胶条使用），加入 7 ml 的凝胶混合物，14 μl 的 TEMED，用手指紧紧的封住针筒的末端，将活塞轻轻地推回到针筒的适当位置，将注射器倒转使针孔向上，让气泡升到上部，移开手指和石蜡膜，不要将注射器指向自己，因为可能会有少量的凝胶混合物喷出，推动活塞直到它完全进入针筒内，然后再堵住针孔。反复颠倒注射器数次以便混匀凝胶混含物，移幵手指推动活塞使气体溢出针筒，直到凝胶混合物刚好要溢出。
(4) 安装 21 gage 针头，缓慢的将凝胶从装置的顶部空隙灌注到两个玻璃板之间，直到凝胶达到第一个切口之间的画线。
(5) 等待 10 min 以便凝胶进行聚合，在等待的同时，取出注射器，丢弃剩余的混合液到适当的容器。用蒸馏水洗涤注射器和针头以便下一次使用，注意要确保没有残留的水。
(6) 凝胶聚合完成后，用一条宽度刚好能够插入到玻璃板之间的 Whatman 纸在两个板中间滑动，吸出上层的未聚合的凝胶溶液。
(7) 重复步骤 (4)~(6)，依次改变凝胶中肽的浓度灌注标号为 1~8 的凝胶条。
(8) 减少凝胶底部与垫片 S 之间的空隙并灌注最后的凝胶条（ 标号为 9）。倾斜装置，以使凝胶溶液流向底部的灌胶梳子，等 10 min 以便凝胶聚合。
(9) 如图 11.7 将装置放平，在灌胶梳子一端稍抬起（大约 5 cm）。去除凝胶梳子，用 Whatman 纸将剩余的未聚合凝胶吸除干净。
(10) 配制 7 ml 肽浓度为 0 的凝胶混合物，加入 14 μl TEMED，然后灌胶直到凝胶混合物到达顶部板的边缘，再加入 1 ml TEMED，插入梳子，聚合 15 min。
(11) 去除底部的垫片及梳子，将灌好的胶装到电泳槽。
(12) 在电泳槽中加入 0.5% TBE 缓冲液（添加盐或去污剂），洗涤上样孔和去除底部垫片后的空隙，不必进行预电冰，将 RNA 样品加到适当的上样孔，上样孔一般只能上 2 μl 的样品。
(13) 凝胶应该在恒定的低电压下进行电泳，以尽量减少热的产生，21 cm X 36 cm 大小，0.8 mm 厚的凝胶在 3W 的条件下（不考虑盐的浓度）可以得到好的分离效果，电泳的吋间控制在 RNA 和肽刚好不跑出凝胶。
(14) 电泳结束后取下凝胶装置，移去一块电泳玻璃板，用塑钭膜盖住凝胶，在塑料膜上标记每个泳道的肽浓度，将凝胶从另一个板上剥离，转移到塑料膜上，用 Whatman 纸覆盖凝胶。
(15) 在凝胶干燥器里干燥 1 h，粘上两点发光的标签作为参照，凝胶对底片曝光适当的时间。
(16) 进行底片显影，使其干燥，利用发光标签将凝胶和底片对齐，在含肽的区域和加样孔区域的交界面做标记，测量从该处到每个条带中央的距离，或者是到条带底部的距离 ( 条带有拖影或者跨越了两个道的分界时），重要的是在一个试验中要采用一致的测量方法。
1. 标准聚丙烯酰胺凝胶电泳设备，包括电源、电泳槽、夹子、热槽（1/8 英寸厚的铝板）。
2. 宽而短的凝胶，因为宽的凝胶可以包含更多的浓度梯度，短的凝胶可以减少每个聚丙烯酰胺条需要的肽量，一般尺寸为 24 cm X 36 cm 或 26 cm X 36 cm( h X w )，凝胶的实际尺寸并不是至关重要的，在具体应用时这个操作程序同样可以在其他尺寸的凝胶应用。
3. 针对 PACE 凝胶，梳子和垫片要进行一定的切割，如图 11.5 所描述对梳子和垫片进行切割，切割以后的凝胶可以包括 10 个肽浓度。
4. 10 ml Luer 注射器，25 gage 针头，手套和石蜡膜。
5. 低放射性标记物。
6. 层析纸，塑料膜和凝胶干燥器。
7. 暗盒，X 射线片和显影剂。
8. 放射物质定量仪器。
9. 5X TBE 凝胶储存缓冲液和电泳缓冲液：450 mmol/L Tris 碱，450 mmol/L 硼酸，10 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
10. 40% 丙烯酰胺储存液（29：1，丙烯酰胺：甲叉甲双丙烯酰胺）。
11. 10% 过硫酸铵（API 水溶液（m/V），99% TEMED。
12. 32P 标记的 RNA 底物，PACE 可以使用 3'，5' 或者内部标记的 RNA。可以采用标准的程序制备 RNA 样品，如果仅有痕量浓度的 RNA 上样到 PACE 凝胶，则要求高的放射活性（> 200 dμm/fmol）。
13. 制备并纯化肽或者蛋白。因为 PACE 测定非常敏感，高纯度和精确浓度的肽是最基本的要求，一般采用反向高效液相色谱（PR-HPLC）或其他的高精度的纯化方法进行纯化，蛋白或肽溶液要用水或合适的储存缓冲液进行系列稀释。储存液通常配制为 100X，在使用时稀释 100 倍。
14. RNA 样品稀释到 6X 的 Ⅲ 型上样染料中：0.24% 溴酚蓝，0.24% 的二甲苯青 FF，30% 的甘油水溶液。
15. 考马斯亮蓝蛋白染色：0.24% 考马斯亮蓝，45% 甲酵的 10% 冰醋酸水溶液，用来标定 PACE 电泳的时间。
二、试验方法
1. 检测
(1) 用去污剂仔细清洗每个凝胶板并用水冲干净，然后再用乙醇淋洗，理想硅化板可以保证灌注后凝胶混合物均匀分布。如图 11.6 所示安装凝胶板、梳子和垫片，将其旋转 90°。滑动取出上部的垫片（S）创造一个灌胶的空隙，在 B 和 P 相对的毎个缺口的顶部之间画线，标定每个肽浓度凝胶的灌注高度，标记每个道并记录所使用的肽储存液浓度。
(2) 制备 200 ml 凝胶混合物：0.5X TBE，15% ( 29：1）丙烯酰胺，0.02% 的过硫酸铵（20 ml 5X TBE 储存液，75 ml 40% 的丙烯酰胺储疗液，400 μl 10% 的 AP，104.6 ml 重蒸水）。使用时添加盐（Na+，K+，Mg2+ 等）、去污剂或其他缓冲液成分到合适的终浓度。为了快速完全聚合，使用真空抽气机进行脱气，直到不强烈的产生气泡。如果使用去污剂，要在脱气以后加入，凝胶混合物终体积为 200 ml。
(3) 去除注射器的活塞，用石蜡膜封住针筒下部的孔并保持竖直，加入 70.7 μl 100X 肽储存液（或缓冲液，在肽浓度为 0 的凝胶条使用），加入 7 ml 的凝胶混合物，14 μl 的 TEMED，用手指紧紧的封住针筒的末端，将活塞轻轻地推回到针筒的适当位置，将注射器倒转使针孔向上，让气泡升到上部，移开手指和石蜡膜，不要将注射器指向自己，因为可能会有少量的凝胶混合物喷出，推动活塞直到它完全进入针筒内，然后再堵住针孔。反复颠倒注射器数次以便混匀凝胶混含物，移幵手指推动活塞使气体溢出针筒，直到凝胶混合物刚好要溢出。
(4) 安装 21 gage 针头，缓慢的将凝胶从装置的顶部空隙灌注到两个玻璃板之间，直到凝胶达到第一个切口之间的画线。
(5) 等待 10 min 以便凝胶进行聚合，在等待的同时，取出注射器，丢弃剩余的混合液到适当的容器。用蒸馏水洗涤注射器和针头以便下一次使用，注意要确保没有残留的水。
(6) 凝胶聚合完成后，用一条宽度刚好能够插入到玻璃板之间的 Whatman 纸在两个板中间滑动，吸出上层的未聚合的凝胶溶液。
(7) 重复步骤 (4)~(6)，依次改变凝胶中肽的浓度灌注标号为 1~8 的凝胶条。
(8) 减少凝胶底部与垫片 S 之间的空隙并灌注最后的凝胶条（ 标号为 9）。倾斜装置，以使凝胶溶液流向底部的灌胶梳子，等 10 min 以便凝胶聚合。
(9) 如图 11.7 将装置放平，在灌胶梳子一端稍抬起（大约 5 cm）。去除凝胶梳子，用 Whatman 纸将剩余的未聚合凝胶吸除干净。
(10) 配制 7 ml 肽浓度为 0 的凝胶混合物，加入 14 μl TEMED，然后灌胶直到凝胶混合物到达顶部板的边缘，再加入 1 ml TEMED，插入梳子，聚合 15 min。
(11) 去除底部的垫片及梳子，将灌好的胶装到电泳槽。
(12) 在电泳槽中加入 0.5% TBE 缓冲液（添加盐或去污剂），洗涤上样孔和去除底部垫片后的空隙，不必进行预电冰，将 RNA 样品加到适当的上样孔，上样孔一般只能上 2 μl 的样品。
(13) 凝胶应该在恒定的低电压下进行电泳，以尽量减少热的产生，21 cm X 36 cm 大小，0.8 mm 厚的凝胶在 3W 的条件下（不考虑盐的浓度）可以得到好的分离效果，电泳的吋间控制在 RNA 和肽刚好不跑出凝胶。
(14) 电泳结束后取下凝胶装置，移去一块电泳玻璃板，用塑钭膜盖住凝胶，在塑料膜上标记每个泳道的肽浓度，将凝胶从另一个板上剥离，转移到塑料膜上，用 Whatman 纸覆盖凝胶。
(15) 在凝胶干燥器里干燥 1 h，粘上两点发光的标签作为参照，凝胶对底片曝光适当的时间。
(16) 进行底片显影，使其干燥，利用发光标签将凝胶和底片对齐，在含肽的区域和加样孔区域的交界面做标记，测量从该处到每个条带中央的距离，或者是到条带底部的距离 ( 条带有拖影或者跨越了两个道的分界时），重要的是在一个试验中要采用一致的测量方法。
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