体外转录合成siRNA分子实验

采用噬菌体 RNA 聚合酶（T7、T3 或 SP6 RNA 聚合酶）可以很方便地在体外合成 siRNA 分子的正义与反义 RNA 链，然后再通过退火形成双链的 siRNA 分子。体外转录合成 siRNA 分子与化学合成双链 RNA 分子相比，其成本相对要低得多，而且有研究报道前者对靶基因的抑制效果明显优于后者，这可能是由于它们的化学性质不同造成的。在实验室中较常采用 T7 RNA 聚合酶体外转录合成 siRNA 分子。

DNA 寡核苷酸
SilenceTM siRNA Construction 试剂盒 核酸转染试剂

一、材料与设备

1. 工人合成的 DNA 寡核苷酸（带有 T7 启动子）。

2. SilenceTM siRNA Construction 试剂盒（Ambion 公司）。

3. 核酸转染试剂（如 Lipofetaminc 2000) 。

二、操作方法

1. 设计并合成两条长 29 nt 的 DNA 寡核苷酸（作为合成 siRNA 的模板），它包含一 段 21 nt 的 siRNA 序列和一段 8 nt 的与 T7 启动子（试剂盒提供）3' 端互补的序列（5'-CCT-GTCTC-3' )。

2. 用经 DEPC 处理的无菌水溶解合成的正、反义链 DNA 模板至终浓度为 100 μmol/L 首先将合成的两条 siRNA 分子模板分别与 T7 启动子引物杂交。反应体系如下：T7 启动子引物 2 μl，DNA 杂交缓冲液 6 μl，siRNA 分子单链 DNA 模板 2 μl，总体积 10 μI。
将混合液于 70℃ 变性 5 min，然后冷却至室温并放置 5 min。

3. 然后采用 DNA 聚合酶 ⅠKlenow 大片段进行延伸，产生双链的 siRNA 分子转录模板。反应体系如下：DNA 模板混合液 10 μl，10X KIenow 反应缓冲液 2 μl，10X dNTP 混合液 2 μl，无核酸酶水 4 μl，Exo-Klenow 2 μl，总体积 20 μl。
轻轻混匀后置于 37℃ 反应 30 min。

4. 对于每个 siRNA 分子应该进行两次体外转录反应以分别合成 siRNA 分子的正义与反义链。每个转录反应都要按照如下的顺序加入相应的成分：正义或反义 siRNA 链模板（步骤(3) 的反应产物）2 μl，无核酸酶水 4 μl，2X NTP 混合物 10 μl，10X T7 反应缓冲液 2 μl，T7 RNA 聚合酶 2 μl，总体积 20 μl。

将上述组分轻轻混匀后置于 37℃ 反应 2 h，然后将正义与反义 RNA 转录产物混合，置 37°C 水浴过夜（>16 h) ，使正义与反义RNA 单链分子退火形成双链的 siRNA 分子。

5. 在转录产物中加入 DNase 和单链特异性的 RNase T1，37℃ 处理 2 h，以去除 DNA 模板、siRNA 引导序列以及未杂交的 RNA 分子，然后加入 400 μl 的 siRNA 结合缓冲液并置于室温 2~5 min。

6. 在含有滤膜的 siRNA 分子制备离心柱中加入 100 μl siRNA 漂洗缓冲液（wash buffer )， 再加入步骤 (5) 获得的 siRNA 溶液，室温 10000 r/min 离心 1 min，弃洗液并用 500 μl 漂洗缓冲液重复洗离心柱一次。

7. 将离心柱置于一个干净的 1.5 ml Eppendoff 离心管中，在离心柱中加入预热到 75℃ 的无核酸酶的水，并置于室温 2 min，然后室温 12000 r/min，离心 2 min，洗脱液即为纯化的 siRNA 分子。用紫外分光光度计确定所制备的 siRNA 溶液的浓度。

8. 取制备好的 siRNA 分子在 Lipoktaminc 2000 介导下转染细胞，或置 -70°C 保存备用。