引物延伸法 RNA 分析
材料与仪器T4 多核苷酸激酶 AMV 反转录酶 酵母 tRNA10X 激酶缓冲液 5X 杂交缓冲溶液 Tris-HCl MgCl2 DTT 放线菌酮 D dNT
材料与仪器
T4 多核苷酸激酶 AMV 反转录酶 酵母 tRNA
10X 激酶缓冲液 5X 杂交缓冲溶液 Tris-HCl MgCl2 DTT 放线菌酮 D dNTP RNasin 甲酰胺上样染液 SephadexG-25 NaAc 乙醇 [r-32P]ATP
水浴 杂交炉 电泳设备
10X 激酶缓冲液 5X 杂交缓冲溶液 Tris-HCl MgCl2 DTT 放线菌酮 D dNTP RNasin 甲酰胺上样染液 SephadexG-25 NaAc 乙醇 [r-32P]ATP
水浴 杂交炉 电泳设备
步骤
一、材料与设备
1) 水浴
2) 杂交炉
3) 电泳设备
4)T4 多核苷酸激酶，AMV 反转录酶
5)10X 激酶缓冲液：5mol/LTris-HCl(pH7.6)，0.lmol/LMgCL2，50 mmol/LDTT，lmmol/L 亚精胺.1 mmol/LEDTA
6)5X 杂交缓冲溶液；2 mmol/LNaCl,50 mmol/LPTPES(pH6.4)
7)1X 延伸溶液：
lmol/LTris-HCl(pH8.3) 10ul
120 mmol/LMgCl2 10ul
200 mmol/LDTT 10ul
1 mg/ml 放线菌酮 D 5ul
lOmmol/LdNTP 10ul
RNasin 40U 1ul
加水至 I78ul
8) 甲酰胺上样染液：80% 去离子甲酰胺，45 mmol/LTris-HCl(pH8.3)，45 mmol/L 硼酸，1.25 mmol/LEDTA，0.02% 二甲苯青
9)SephadexG-25, 用约 50 倍体积的 TE[10 mmol/LTris-HCl(pH8.0),1.0 mmol/LEDTA] 重悬 SephadexG-25, 高压灭菌 15 min，冷却后存于 4℃
10) 酵母 tRNA: 浓度为 25 mg/ml，用 DEPC 水配制，注意避免 RNase 的污染，保存于塑料瓶中，存于一 20℃
11)3mol/LNaAc
12)70% 乙醇：用 DEPC 水配制
13)[r-32P]ATP
二、操作方法
(一）用 T4 多聚核苷酸激酶放射性标记引物
1) 将引物溶于水或 TE 缓冲液中，终浓度为 0.4ug/ul，再依次加人下列组分:
引物 1〜5pmol(0.4ug)
10X 激酶缓冲液 1ul
[γ-32P]ATP 35uCi(3000Ci/mmolL)
T4 多聚核苷酸激酶 20U
DEPC 水补足 10ul
2) 混合并于 37℃ 温育 0.5〜lh，加入 250 mmol/LEDTA 终止反应
3) 用 TE 将总体积加至 100ul。通过 SephadexG-25 柱将未标记的引物从激酶化的引物中分离出来，收集第一个放射活性峰，65℃ 温育 l0 min 以灭活了 T4 多聚核苷酸激酶
4) 用等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24:1) 抽提，向水相中加入 NaAc 和 MgCl2 至终浓度分別为 0.3mol/L 和 5 mmol/L, 并加入 lOugtRNA。加入 2.5 倍体积的无水乙醇. 放在干冰中 10 min，12000 g 4℃ 离心 30 min, 用 70% 的乙醇离心洗涤沉淀. 将沉淀干燥并重溶于 80ul 无菌水中
(二）杂交
1) 在微量管中，混合下列组分：
靶 RNA 0.1〜5fmol(最多为 20ug 的总 RNA)
SX 杂交缓冲液 4ul
标记的引物 1〜50fmol
加水至 20ul
2) 于 70℃，温育 3 min
3) 在 54℃ 杂交 1.5〜4 h
(三) 延伸反应
1) 样品屮加入 178ul 延伸缓冲液，置与冰上
2) 加入 lul RNasin 和 1ul 反转录酶,42°C: 保温 lh
3) 加入 20ul 和 2.5 倍体积的无水乙醇，在干冰中放置 10 min,12000g 离心 15 min, 用 70% 乙醇离心洗涤，空气干燥 2 min
4) 用甲酰胺上样染液重悬沉淀，注意要充分混匀。
5）90℃ 热变性 3 min, 然后置于冰上
6) 将 8ul 样品上样于变性聚丙烯酰胺凝胶，同时加入 DNA 分子质量标准物后进行电泳
1) 水浴
2) 杂交炉
3) 电泳设备
4)T4 多核苷酸激酶，AMV 反转录酶
5)10X 激酶缓冲液：5mol/LTris-HCl(pH7.6)，0.lmol/LMgCL2，50 mmol/LDTT，lmmol/L 亚精胺.1 mmol/LEDTA
6)5X 杂交缓冲溶液；2 mmol/LNaCl,50 mmol/LPTPES(pH6.4)
7)1X 延伸溶液：
lmol/LTris-HCl(pH8.3) 10ul
120 mmol/LMgCl2 10ul
200 mmol/LDTT 10ul
1 mg/ml 放线菌酮 D 5ul
lOmmol/LdNTP 10ul
RNasin 40U 1ul
加水至 I78ul
8) 甲酰胺上样染液：80% 去离子甲酰胺，45 mmol/LTris-HCl(pH8.3)，45 mmol/L 硼酸，1.25 mmol/LEDTA，0.02% 二甲苯青
9)SephadexG-25, 用约 50 倍体积的 TE[10 mmol/LTris-HCl(pH8.0),1.0 mmol/LEDTA] 重悬 SephadexG-25, 高压灭菌 15 min，冷却后存于 4℃
10) 酵母 tRNA: 浓度为 25 mg/ml，用 DEPC 水配制，注意避免 RNase 的污染，保存于塑料瓶中，存于一 20℃
11)3mol/LNaAc
12)70% 乙醇：用 DEPC 水配制
13)[r-32P]ATP
二、操作方法
(一）用 T4 多聚核苷酸激酶放射性标记引物
1) 将引物溶于水或 TE 缓冲液中，终浓度为 0.4ug/ul，再依次加人下列组分:
引物 1〜5pmol(0.4ug)
10X 激酶缓冲液 1ul
[γ-32P]ATP 35uCi(3000Ci/mmolL)
T4 多聚核苷酸激酶 20U
DEPC 水补足 10ul
2) 混合并于 37℃ 温育 0.5〜lh，加入 250 mmol/LEDTA 终止反应
3) 用 TE 将总体积加至 100ul。通过 SephadexG-25 柱将未标记的引物从激酶化的引物中分离出来，收集第一个放射活性峰，65℃ 温育 l0 min 以灭活了 T4 多聚核苷酸激酶
4) 用等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24:1) 抽提，向水相中加入 NaAc 和 MgCl2 至终浓度分別为 0.3mol/L 和 5 mmol/L, 并加入 lOugtRNA。加入 2.5 倍体积的无水乙醇. 放在干冰中 10 min，12000 g 4℃ 离心 30 min, 用 70% 的乙醇离心洗涤沉淀. 将沉淀干燥并重溶于 80ul 无菌水中
(二）杂交
1) 在微量管中，混合下列组分：
靶 RNA 0.1〜5fmol(最多为 20ug 的总 RNA)
SX 杂交缓冲液 4ul
标记的引物 1〜50fmol
加水至 20ul
2) 于 70℃，温育 3 min
3) 在 54℃ 杂交 1.5〜4 h
(三) 延伸反应
1) 样品屮加入 178ul 延伸缓冲液，置与冰上
2) 加入 lul RNasin 和 1ul 反转录酶,42°C: 保温 lh
3) 加入 20ul 和 2.5 倍体积的无水乙醇，在干冰中放置 10 min,12000g 离心 15 min, 用 70% 乙醇离心洗涤，空气干燥 2 min
4) 用甲酰胺上样染液重悬沉淀，注意要充分混匀。
5）90℃ 热变性 3 min, 然后置于冰上
6) 将 8ul 样品上样于变性聚丙烯酰胺凝胶，同时加入 DNA 分子质量标准物后进行电泳
注意事项
1) 延伸反应产物的总暈与退火时间的 K 短成正比的增加（退火时间不超过 12 h）若超过 12 h 即使增加退火时间也不显著增加反应产物总量，因为产物形成中增加的部分会由于非特异性降解而失去
2) 所需总 RNA 的 M 决定于靶 RNA 的浓度，最好通过预试验以确定出 RNA 的浓度范，从而得到满意的结果
3) 使用短至 17 个核_ff 酸的引物也很成功，当为引物延伸测定法设汁引物时，其靶序列务必位于 RNA5＇末端的 100 个核苷酸的区域之内，这样可减少潜在的不均一延伸产物，它们的产生岳由于反转录酶在模板 KNA 的一级结构区域里终止或暂停作用造成的。单链的寡核苷酸（5＇端未磷酸化）是引物域力便的来源 D 此外，引物也可以从相应的克降的基因通过限制酶消化而获得。利用一对相距 20〜l0 bp 并可产牛. 不同长度的黏性未端的稀有酶切的位点，经酶切后产生不同长度的条编码链和一条非编码链。对两次切割位点之间的片段作放射性标汜可产生个独一无二的末端标汜片段，在变忡的内烯酰胺凝胶上. 电泳和放射 D 显影后町以将其与非编砰链分开。两条链的长度相差愈大，限制酶切的片段就愈小. 探针的分离也就愈好。也可用一个独一无二的末端标记的双链引物. 因为 RNA-DNA 杂合分子比 DNA-DNA 杂合分子更稳定（其最适杂交温度大约尚 5℃)。不过用双链引物时需精确测定杂交温度，这就降低了这一技术的效率。理想的情况是引物应标记 5＇端，限制晦切片段的 V 端磷酸必须在激酶处理之前先用碱性磷酸酯酶除去，不过如仅仅用作对某个 mRNA 的定量测定，那么 3＇标记也是可以的。实际应用限制酶所产生的探计可能更为简单一些（例如，对于产生不同大小的链标可能是重要的），采用均匀标记的探针可使引物延仲分析法的灵敏度得到改进。引物离帽位点愈远，则反转录酶的作用在 RNA 二级结构的部位上或在 RMA 降解（例如被 RNase 降解）的部位上过早终止的可能性就愈大，这些不连续的「早熟」的带他帽位点信号减弱。如将引物的位点移到对延伸存强大阻砑作用的二级结构的 5＇端处，则可以改进帽位产物的得率.
4) 若将标记引物与止在制备的待分析 RNA 先行合，引物与 RNA 便可以共沉淀下来，沉淀可溶于 DEPC 水中，杂交反应所需的其他成分便可直接加入此 S 新悬浮的沉淀中，引物和待分析的 RNA 与杂交缓冲液混合，加热至 70℃ 破坏 RNA(或引物）的二级结构，然后再进行复性
5) 杂交时引物浓度约为互补的 RNA 摩尔浓度的 10 倍，如果超过太多〔特别是当杂交严格度低于最适时）会造成非特异性的启动。杂交的最适温度取决于引物的 K 度及其碱基组成。计算 RNA-DNA 杂合分子的解链温度的公式并不适用于计算短链的 DNA 引物。大多数探针的解链温度在指定的缓冲液中为 45〜65℃。应该用这范围内的温度进行小规模的试验，对专一的引物-mRNA 的结合确定最适杂交温度&杂交反应进行 3〜6 h。在高温中 RNA 对热敏感，因此最适杂交温度高的#物复性时间愈短愈好
6) 检测杂交效率的一个简单办法是对 RNA-以物杂合分子作一个修正的 S1 核苛酸定位试验。就是将寡核背酸和 RNA 在待确定的杂交溫度范围内杂交 3〜6 h，用 S1 核酸酶消化余合分子，然后在变性的丙烯酰胺凝胶上电泳，测定被保护的（杂交的）寡核苷酸量。产生最大的抗 S1 核酸酶的标记物的温度应诙用作以正式的杂交反应温度
7) 应该对目标 mRNA 的用量优化，即通过用不同量的 RNA 制备物进行个典型的杂交反应，这里可以用细胞质总 RNA，不过用poly(A)+ RNA 可以得到灵敏度更髙和更清晰的结果。
8) 核糖核酸酶抑制剂 RNasin 可以用在延伸反应中（1ul，约为 40U)，但在杂交反应中效果较小，因为在保温会消除二级结构以及在高温进行的复性反应，这样都能使 RNasin 的蛋白质变性。此外 RNasin 的活件严格依赖于最低量的 1 mmol/L 二硫苏糖醇，而一硫苏糖醇在高温屮也不稳定。延伸反应在 42°C 进行以减少 mRNA 的二级结构的形成，后者可以使反转录过早终止, 延伸反应件往在帽邻近处形成不止一条带，这可能代表真正的转录多起始点，此外，认为如果 mRNA 的帽位上的或邻接的核苷酸 上 发生甲基化，则可使反转录酶的作用在一部分分子中过早终止。在精确测定转洪起始点时，这些影响都应加以考虑。在不同甩的转染细胞中的几种帽位点条带之间的比例有所不 同，但对一定来源的 mRNA 此比例则保持恒定不变
9) 反转珙酶催化的 cDNA 冋折合成吋以形成额外的条带，刼管在延伸缓冲液中加入的放线菌素 D 能够降低这一活件。焦磷酸钠（80 mmol/L) 似乎效果更好，但它对某些来源的反转录酶忖能有抑制作用。引物与组织培养细胞的内源性 RNA 或与载体 rRNA 之间的交叉有时吋以 W 致出现假带。从不表达该基因的细胞中分离 RNA 作引物延伸反应并将其作为对照，就可以鉴定出这拽假带 D
2) 所需总 RNA 的 M 决定于靶 RNA 的浓度，最好通过预试验以确定出 RNA 的浓度范，从而得到满意的结果
3) 使用短至 17 个核_ff 酸的引物也很成功，当为引物延伸测定法设汁引物时，其靶序列务必位于 RNA5＇末端的 100 个核苷酸的区域之内，这样可减少潜在的不均一延伸产物，它们的产生岳由于反转录酶在模板 KNA 的一级结构区域里终止或暂停作用造成的。单链的寡核苷酸（5＇端未磷酸化）是引物域力便的来源 D 此外，引物也可以从相应的克降的基因通过限制酶消化而获得。利用一对相距 20〜l0 bp 并可产牛. 不同长度的黏性未端的稀有酶切的位点，经酶切后产生不同长度的条编码链和一条非编码链。对两次切割位点之间的片段作放射性标汜可产生个独一无二的末端标汜片段，在变忡的内烯酰胺凝胶上. 电泳和放射 D 显影后町以将其与非编砰链分开。两条链的长度相差愈大，限制酶切的片段就愈小. 探针的分离也就愈好。也可用一个独一无二的末端标记的双链引物. 因为 RNA-DNA 杂合分子比 DNA-DNA 杂合分子更稳定（其最适杂交温度大约尚 5℃)。不过用双链引物时需精确测定杂交温度，这就降低了这一技术的效率。理想的情况是引物应标记 5＇端，限制晦切片段的 V 端磷酸必须在激酶处理之前先用碱性磷酸酯酶除去，不过如仅仅用作对某个 mRNA 的定量测定，那么 3＇标记也是可以的。实际应用限制酶所产生的探计可能更为简单一些（例如，对于产生不同大小的链标可能是重要的），采用均匀标记的探针可使引物延仲分析法的灵敏度得到改进。引物离帽位点愈远，则反转录酶的作用在 RNA 二级结构的部位上或在 RMA 降解（例如被 RNase 降解）的部位上过早终止的可能性就愈大，这些不连续的「早熟」的带他帽位点信号减弱。如将引物的位点移到对延伸存强大阻砑作用的二级结构的 5＇端处，则可以改进帽位产物的得率.
4) 若将标记引物与止在制备的待分析 RNA 先行合，引物与 RNA 便可以共沉淀下来，沉淀可溶于 DEPC 水中，杂交反应所需的其他成分便可直接加入此 S 新悬浮的沉淀中，引物和待分析的 RNA 与杂交缓冲液混合，加热至 70℃ 破坏 RNA(或引物）的二级结构，然后再进行复性
5) 杂交时引物浓度约为互补的 RNA 摩尔浓度的 10 倍，如果超过太多〔特别是当杂交严格度低于最适时）会造成非特异性的启动。杂交的最适温度取决于引物的 K 度及其碱基组成。计算 RNA-DNA 杂合分子的解链温度的公式并不适用于计算短链的 DNA 引物。大多数探针的解链温度在指定的缓冲液中为 45〜65℃。应该用这范围内的温度进行小规模的试验，对专一的引物-mRNA 的结合确定最适杂交温度&杂交反应进行 3〜6 h。在高温中 RNA 对热敏感，因此最适杂交温度高的#物复性时间愈短愈好
6) 检测杂交效率的一个简单办法是对 RNA-以物杂合分子作一个修正的 S1 核苛酸定位试验。就是将寡核背酸和 RNA 在待确定的杂交溫度范围内杂交 3〜6 h，用 S1 核酸酶消化余合分子，然后在变性的丙烯酰胺凝胶上电泳，测定被保护的（杂交的）寡核苷酸量。产生最大的抗 S1 核酸酶的标记物的温度应诙用作以正式的杂交反应温度
7) 应该对目标 mRNA 的用量优化，即通过用不同量的 RNA 制备物进行个典型的杂交反应，这里可以用细胞质总 RNA，不过用poly(A)+ RNA 可以得到灵敏度更髙和更清晰的结果。
8) 核糖核酸酶抑制剂 RNasin 可以用在延伸反应中（1ul，约为 40U)，但在杂交反应中效果较小，因为在保温会消除二级结构以及在高温进行的复性反应，这样都能使 RNasin 的蛋白质变性。此外 RNasin 的活件严格依赖于最低量的 1 mmol/L 二硫苏糖醇，而一硫苏糖醇在高温屮也不稳定。延伸反应在 42°C 进行以减少 mRNA 的二级结构的形成，后者可以使反转录过早终止, 延伸反应件往在帽邻近处形成不止一条带，这可能代表真正的转录多起始点，此外，认为如果 mRNA 的帽位上的或邻接的核苷酸 上 发生甲基化，则可使反转录酶的作用在一部分分子中过早终止。在精确测定转洪起始点时，这些影响都应加以考虑。在不同甩的转染细胞中的几种帽位点条带之间的比例有所不 同，但对一定来源的 mRNA 此比例则保持恒定不变
9) 反转珙酶催化的 cDNA 冋折合成吋以形成额外的条带，刼管在延伸缓冲液中加入的放线菌素 D 能够降低这一活件。焦磷酸钠（80 mmol/L) 似乎效果更好，但它对某些来源的反转录酶忖能有抑制作用。引物与组织培养细胞的内源性 RNA 或与载体 rRNA 之间的交叉有时吋以 W 致出现假带。从不表达该基因的细胞中分离 RNA 作引物延伸反应并将其作为对照，就可以鉴定出这拽假带 D
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