SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

相关专题   实验目的：测定蛋白质亚基的分子 量及纯度 实验原理：在样品介质和聚丙烯酰胺 凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的点泳迁移率主要取决于亚及分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，可以用来测定蛋白质亚基的分子量。 基本过程：制胶、电泳、检测 试剂：（储液由专业人员配置）30%丙烯酰胺单体储液、10%过硫酸铵、TEMED、1.5mol/L Tris-HCl, pH8.8、1.0mol/L Tris-HCl, pH6.8、10%SDS、10XTris-甘氨酸系统的电泳缓冲液、2Xloading buffer、水饱和正丁醇 器材：灌胶支架、玻璃板、梳子、电源、加热器、电泳槽 、扫描仪 实验操作程序： 1．安装灌胶模具，依照说明书进行 2．按照配方配置一定量（7cm模具配置1mm厚的胶配置5ml）的分离胶溶液和浓缩胶溶液（2ml），过硫酸铵和TEMED在用前加入。 3．分离胶溶液充分混匀后从一侧加入灌胶模具，上方留约1.5-2cm用于加浓缩胶，小心的在分离胶的表面加一层水饱和正丁醇（或水饱和的异丙醇、水），封住胶面，以促使聚合并保持胶面平整。 4．室温放置40分钟到1小时后，可以看到一个界面，去掉上层覆盖液，用浓缩胶缓冲液淋洗胶面，然后灌制浓缩胶，并插入与模具大小相同，凝胶厚度相当的梳子。 5．静止放置40-60分钟使凝胶聚合，电泳液清洗样品孔。 6．制备好的蛋白质样品用2Xloading buffer 1：1混合，与分子量marker 一起100℃煮3-5min, 12000rpm离心5-10min，（7cm模具、1mm厚度、10孔、考染上样量30ug） 7．加入下槽液，把夹有凝胶的玻板转移到电泳槽，加入上槽液，上样。 8．连接电源，5-10mA/胶开始电泳，待溴酚蓝前沿到达分离胶后加大电流到10-15mA/胶， 9．溴酚蓝前沿到达玻璃板底部时停止电泳，取出凝胶，做好标记，准备染色。 10．染色。见考马斯亮蓝染色操作规程及银染色操作规程。 11．扫描。扫描操作见扫描仪的使用说明。 注意事项 1．在加过硫酸铵和TEMED之前溶液最好抽气，防止溶解在溶液里的分子氧在聚合时产生气泡使胶不均一。 2．过硫酸铵和TEMED的量应根据室温和聚合情况而定。 3．分离胶聚合后最好在4℃放置12小时后再使用，以使凝胶充分聚合，改善电泳时的分辨率。 4．为防止气泡陷入，梳子应倾斜插入。 5．如果带着梳子过夜可能会影响分辨率，所以浓缩胶最好在使用前再灌制。 6．如果没有足够数目的样品，应在加样孔中加样品缓冲液，不要留有空孔，以防止电泳时邻近的带扩展。 7．对样品浓度不确定的情况下，加样时使用梯度加样法，能大致估计出样品的浓度。 参考文献： 1．《蛋白质电泳实验技术》郭尧君编著