羧肽酶的分离纯化方法

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【目的要求】

1.实验目的

⑴ 通过学习生化及相关学科的理论和技术，熟悉并进一步掌握酶的提取、分离、纯化、检测及其生物学性质和理化性质的实验技能。

⑵ 初步培养从总体水平进行实验的设计，进一步加强并提高综合分析解决问题的能力。

⑶ 培养科研工作中的协作精神和勤俭而高效的科研作风。

2.实验要求

⑴ 本实验由面包酵母为初始材料，制备高纯度羧肽酶Y，对羧肽酶Y生化性质的检测。

⑵ 通过相关文献资料的收集、分析、设计本实验的可行报告。

⑶ 可行性报告包括实验目的、意义、国内外进展、实验方法和技术路线及可行性分析、实验预期结果。

⑷ 在本实验开始前一个月，将实验报告草案提交指导教师，以审核和准备实验材料等。

⑸ 实验报告草案应提供最少十篇文献，其中至少有两篇是近五年内的文献，包括新技术、新方法在生物大分子 研究中的应用。

(6) 文献按学术期刊论文的格式要求，即作者、文章名、刊名、年、卷(期)、页码，参考书籍类同。

⑺ 本实验基本两人一组，在部分实验中需几组合作进行。

⑻ 实验报告包括：采用实验的原理;实验所需试剂、仪器、设备;提取、分离、纯化的每步骤的蛋白回收率、活性回收率，最终产率;按实验内容，提供实验结果及相关图表;完成实验后从整体上进行相关的讨论。

【实验内容】

1.羧肽酶Y活性检测

⑴ 酶活力测定方法

⑵ 酶活力单位定义

⑶ 比活力定义

⑷ 蛋白含量测定方法

2. 面包酵母羧肽酶Y的提取

⑴ 每组500克新鲜面包酵母

⑵ 利用溶解度等原理进行羧肽酶Y提取

⑶ 羧肽酶Y的活化

3. 羧肽酶Y的分离、纯化

⑴ 利用各种方法，从上述提取液分离羧肽酶Y

⑵ 每步纯化前蛋白纯度检测

⑶ 分离纯化过程中跟踪检测活性组份蛋白质含量和酶活性

4. 羧肽酶Y理化性质

⑴ 采用两种方法验证羧肽酶Y纯度

⑵ 羧肽酶Y的分子量测定

⑶ 羧肽酶Y的等电点测定

5. 羧肽酶Y的酶学性质

⑴ 在活力单位定义确定后，求出羧肽酶Y的Vmax和Km

⑵ 初步确定羧肽酶Y的最适pH

⑶ 初步确定羧肽酶Y的最适温度

⑷ 提出最少两种羧肽酶Y的可逆抑制剂并验证抑制类型

⑸ 提出羧肽酶Y的激活性并验证

(6) 羧肽酶Y的热稳定性

【实验原理】

羧肽酶Y(Carboxypeptidase Y)是由面包酵母中分离得到的一种蛋白水解酶，它对肽和蛋白质羧基末端的各种氨基酸(包括脯氨酸)具有广泛的水解能力，因此该酶已成为C末端分析中常用的一种工具酶 。羧肽酶Y与胰羧肽酶A和B不同，它是一种不含金属离子的酸性糖蛋白。

自1967年发现此酶以来，人们对它的理化性质、分子结构以及应用等方面进行了研究。每分子羧肽酶Y约含有16个氨基葡萄糖(glucosamine)残基和15%的己糖。其氨基酸组成中，酸性氨基酸含量较高，等电点为3.6。分子量约为61000Da，在280nm的消光系数

为15.0。该酶活性可被二异丙基氟磷酸(DFP)强烈抑制，因而认为它是属于活性中心含有丝氨酸残基的酶类。羧肽酶Y可被一些金属离子如Cu2+，Hg2+，Fe2+，Mg2+等所抑制。因此在酶的分离制备过程中要防止与金属离子接触。羧肽酶Y在蛋白质变性剂或某些溶剂存在下是相当稳定的，它与6mol/L尿素在25℃保温1小时仍保留大约80%的活性。在10%甲醇存在下，25℃，pH5.5～8.0，8小时内该酶完全稳定。羧肽酶Y水溶液在25℃，pH5.5～8.0范围内，它的活性在8小时内是稳定的。在37℃，pH6～8，2小时内是稳定的。在低于pH3，60℃以上保温时，酶迅速失活。该酶在饱合硫酸铵溶液中，在-20℃可长期保存。1%的酶溶液(pH7.0)在-20℃冰冻保存，二年内不失活。若稀释到0.1mg/L则迅速失活。酶溶液的反复冰冻和融化或延长室温贮存时间，可引起酶本身的自溶。

羧肽酶Y以酶原的形式存在于酵母细胞中，在分离制备时，首先用有机溶剂使酵母细胞自溶破裂，然后在pH5.0进行活化，将酶原转变成酶。经DEAE-纤维素柱层析除去大量杂蛋白，再用DEAE-sephadexA-50柱进行纯化。必要时再通过sephadexG-150柱，可得到更纯的酶。经过以上分离纯化步骤后，酶可提纯400倍以上。用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为一条带。

羧肽酶Y具有肽酶和酯酶活性，可用人工合成的苯甲氧羰二肽(CBZ-Phe-Leu)或N-乙酰酪氨酸乙酯(N-acetyl-L-tyrosine ethyl ester，简称ATEE)为底物，分别测定其肽酶活性或酯酶活性。一般多用紫外分光光度法测定酶活性。

【实验材料】

1. 实验器材

循环水式真空泵;蛋白紫外检测仪;记录仪; 紫外分光光度计; 梯度混合器(500ml);721型光分光光度计;高速冰冻离心机;冰箱;酸度计;部分收集器; 恒流泵;圆盘电泳装置;恒温水浴锅;层析柱(2.6×50cm) (1.0×100cm) (0.6×30cm);布氏漏斗(500ml);吸滤瓶(1000ml);G-3砂芯漏斗(500ml);透析袋;玻璃棒;大烧杯(2000ml)。

2. 实验试剂

⑴ DEAE-离子交换纤维素(DE-32)：称取所需量，先用蒸馏水浸泡至全部溶胀，倾去液面漂浮的小颗粒，抽滤，用水洗至中性;再用0.5mol/L盐酸浸泡30分钟，抽干，用水洗至中性;用0.5mol/L氢氧化钠浸泡30～60分钟，抽干，用水洗至中性;最后再用0.5mol/L盐酸浸泡30分钟，抽干，用水洗至中性;上柱前用所需缓冲液平衡。使用过的交换剂，须先用0.5mol/L氢氧化钠-0.5mol/L氯化钠溶液浸泡，用水充分洗涤后，再按上述方法处理。

⑵ DEAE-Sephadex A-50：处理方法同DEAE-离子交换纤维素(DE-32)，只是将0.5mol/L的酸、碱均改为0.1mol/L。浸泡时间缩短为20分钟。

⑶ Sephadex G-150: 处理方法参见实验五。

⑷ 四甲基乙二胺(TEMED);三羟甲基氨基甲烷(TRIS);十二烷基硫酸钠(SDS);丙烯酰胺(ACM);甲叉双丙烯酰胺(Bis);考马斯亮兰G250;

⑸ 两性电解质(pH3～10);牛血清白蛋白(FBS);

(6) 0.5mmol/L苯甲氧羰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酸(CBZ-Phe-Leu)-0.05mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液: 称取5.17mg CBZ-Phe-Leu，溶于0.05mol/L，pH6.5磷酸盐缓冲液，定容至25ml。

⑺ 1mmol/L N-乙酰酪氨酸乙酯(N-acetyl-L-tyrosine ethyl ester，简称ATEE )-0.05mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液：称取6.25mg ATEE，溶于0.05mol/L，pH7.5磷酸盐缓冲液，定容至25ml。

⑻ 奈氏试剂: 将10g碘化汞和7g碘化钾溶于10ml水中，另将24.4g氢氧化钾溶于内有70ml水的100ml容量瓶中，并冷却至室温。将上述碘化汞和碘化钾溶液慢慢注入容量瓶中，边加边摇动。加水至刻度，摇匀，放置2天后使用。试剂应保存在棕色玻璃瓶中，置暗处。

⑼ 氢氧化钠;盐酸;氯仿;甲苯;新鲜面包酵母(1.5kg);固体硫酸铵; 乙醇;蒸馏水;甲醇;三氯醋酸;丙酮;乙酸;乙酸钠(NaAc·3H2O)

【实验操作】

1.酶的制备

⑴ 自溶：取1.5kg新鲜面包酵母，加入330ml氯仿，用不锈钢勺或粗玻璃棒进行揉搓、搅拌，大约30分钟后开始液化。置30℃水浴中保温，用力搅拌，待完全液化后，加入600ml蒸馏水，搅匀。用1mol/L氢氧化钠溶液调到pH7.0，将混合液于25℃保温2小时，复测溶液pH，再用1mol/L氢氧化钠溶液调到pH7.0，于25℃继续保温16小时左右，使充分自溶。保温完毕，将自溶混合物于4300g离心15分钟，合并上清液(约1400ml),弃去残渣。

⑵ 硫酸铵分级分离：向上清液中加硫酸铵粉末使达0.5饱和度 (313g/L,25℃)，边加边搅拌，用1mol/L氢氧化钠溶液调到pH7.0, 放置2小时后，于8400g离心20分钟，除去沉淀。再向上清液中慢慢加入硫酸铵粉末使达0.9饱和度(302g/L,25℃)，调到pH7.0，搅拌至硫酸铵固体完全溶解后，放置过夜。次日于13000g离心30分钟，收集沉淀。若沉淀中母液较多,需抽滤至干，约得100g滤饼。

⑶ 活化：将滤饼溶于300ml　0.05mol/L，pH5.0乙酸盐缓冲液中，滴加lmol/L乙酸调到pH5.0，并在溶液中加入5～10滴甲苯防腐。将溶液于25℃保温活化18～20小时。活化完成后，留样经透析后测活。

⑷ DEAE纤维素-32柱层析：上述活化液(约600ml)先用0.01mol/L, pH7.0磷酸盐缓冲液进行透析，然后改用含0.1mol/L氯化钠的上述缓冲液透析，用奈氏试剂检查.透析外液中无铵离子为止。透析完毕后，将酶液上DEAE-纤维素-32柱(2.6×50cm)，该柱要预先用含0.1mol/L氯化钠的0.01mol/L, pH7.0磷酸盐缓冲液平衡。当样品吸附完毕后，开始线性洗脱。洗脱液为含氯化钠的0.01mol/L, pH7.0磷酸盐缓冲液，梯度混合器的贮液瓶放280mL含0.42mol/L氯化钠的缓冲液，混合瓶放280mL含0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液。流速30ml/h，4ml/管，用部分收集器收集。洗脱完毕，经过测活后收集酶蛋白活性峰。

⑸ DEAE-Sephadex A-50柱层析：先将上步所得酶活性峰溶液(约200ml)分装于透析袋中，用饱和硫酸铵溶液进行反透析，使酶沉淀。然后调到pH7.0,于5℃放置10小时以上。在以20000g离心30分钟，收集沉淀，将沉淀溶于少量的0.15mol/L氯化钠-0.01mol/L, pH7.0磷酸盐缓冲液，然后对此缓冲液透析。透析完毕，将酶液(约10ml)上DEAE-Sephadex A-50柱层析(0.6×30cm)，该柱要预先用同一缓冲液平衡。样品吸附完毕后，进行线性洗脱。洗脱液为含氯化钠的缓冲液。梯度混合器的贮液瓶放120mL含0.5mol/L氯化钠的缓冲液，混合瓶放120mL含0.15mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液。流速为20ml/h，3ml/管。用部分收集器收集，紫外检测仪于280nm处检测，通过测活，合并酶活性峰的洗脱液。

⑹ Sephadex G-150柱层析: (若有必要可将上面得到的酶溶液经Sephadex G-150柱进一步纯化)

将上步所得酶溶液按步骤(5)所述方法处理。经反透析分离沉淀，溶解和透析除去硫酸铵的酶溶液，再上Sephadex G-150柱(1.0cm×100cm)，该柱预先要用含0.15mol/L氯化钠-0.01mol/L, pH7.0磷酸盐缓冲液平衡。用同一溶液洗脱，流速4.5mL/h，1mL/管，用紫外检测仪于280nm处检测。洗脱体积相当于柱体积。通过此柱后，可得到单一的酶活性峰。经过测活及鉴定后，对饱和硫酸铵溶液反透析，将酶的混悬液于低温冰箱保存。

2.酶活力的测定

⑴ 酯酶活力的测定：以ATEE为底物用分光光度法或滴定法测定酯酶活力。分光光度法具体操作如下：

取两个石英比色池(带盖，光程为1cm)，其中一个加0.05mol/L, pH7.5磷酸盐缓冲液，作为空白对照调零点。另一个比色池加入2.80mL 1mmol/L ATEE—0.05mol/L, pH7.5磷酸盐缓冲液(在25℃预热5分钟)，0.20ml酶液(用量一般含15µg酶蛋白)，立即混匀并记时，与237nm处测其光吸收(降低)，每隔半分钟读一次数。若△A237nm/min > 0.400，则酶液需要适当稀释或减量。每水解1µmol底物引起光吸收降低0.1所需的酶量定为1个酶活力单位。

按以下公式计算羧肽酶Y的活力单位和比活力。

式中：△A237nm为任选的t时间间隔(min)内光吸收值的变化(降低);ε为测定时所用酶蛋白量(µg);1000为酶蛋白由µg换算成mg的转换值;0.1为光吸收降低，0.1定为1个酶活力单位的常数。

⑵ 肽酶活力测定：一般用苯甲氧羰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酸(CBZ-Phe-Leu)作为底物，用分光光度法或茚三酮溶液显色法测定。

分光光度法用224nm测定光吸收的降低。底物用0.5mmol/L，CBZ-Phe-Leu-0.05mol/L, pH6.5磷酸盐缓冲液，酶用量一般5～10µg蛋白，操作和计算方法与酯酶的活力测定类似。每水解1µmol底物引起光吸收降低0.2所需的酶量定为1个酶活力单位。

式中：△A237nm为任选的t时间间隔(min)内光吸收值的变化(降低);ε为测定时所用酶蛋白量(µg);1000为酶蛋白由µg换算成mg的转换值;0.1为光吸收降低，0.1定为1个酶活力单位的常数。

⑶肽酶活力测定：一般用苯甲氧羰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酸(CBZ-Phe-Leu)作为底物，用分光光度法或茚三酮溶液显色法测定。

分光光度法用224nm测定光吸收的降低。底物用0.5mmol/L，CBZ-Phe-Leu-0.05mol/L, pH6.5磷酸盐缓冲液，酶用量一般5～10µg蛋白，操作和计算方法与酯酶的活力测定类似。每水解1µmol底物引起光吸收降低0.2所需的酶量定为1个酶活力单位。

3. 蛋白质含量的测定：

采用Folin-酚试剂法进行测定。

4. 纯度检测：

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。

5. 理化和酶学性质的测定

学生可根据酶纯化和活力测定的结果，运用已掌握的生化知识和实验技能自行设计方案进行探索研究。

【实验结果】

将实验数据总结于下表：