肌糖原的酵解作用

验原理

在动物、植物、微生物等许多生物机体内，糖的无氧分解几乎都按完全相同的过程进行。本实验以动物肌肉组织中肌糖原的酵解过程为例。肌糖原的酵解作用，即肌糖原在缺氧的条件下，经过一系列的酶促反应，最后转变成乳酸的过程。

肌肉组织中的肌糖原首先磷酸化，经过己糖磷酸酯、丙糖磷酸酯、甘油磷酸酯等一系列中间产物，最后生成乳酸。该过程可综合成下列反应式：

肌糖原的酵解作用是糖类供给组织能量的一种方式。当机体突然需要大量的能量，而又供氧不足（如剧烈运动时），则糖原的酵解作用可暂时满足能量消耗的需要。在有氧条件下，组织内糖原的酵解作用受到抑制，而有氧氧化则为糖代谢的主要途径。

糖原酵解作用的实验，一般使用肌肉糜或肌肉提取液。在用肌肉糜时，必须在无氧条件下进行；而用肌肉提取液，则可在有氧条件下进行。因为催化酵解作用的酶系统全部存在于肌肉提取液中，而催化呼吸作用（即三羧酸循环和氧化呼吸链）的酶系统，则集中在线粒体中。

糖原或淀粉的酵解作用，可由乳酸的生成来观测。在除去蛋白质与糖以后，乳酸可以与硫酸共热变成乙醛，后者再与对羟基联苯反应产生紫罗兰色物质，根据颜色的显现而加以鉴定。

该法比较灵敏，每毫升溶液含1－5μg乳酸即给出明显的颜色反应。若有大量糖类和蛋白质等杂质存在，则严重干扰测定，因此实验中应尽量除净这些物质。另外，测定时所用的 仪器 应严格地洗干净。

试剂 和器材

一、 试剂

对羟基联苯试剂：称取对羟基联苯1.5g，溶于100mL 0.5% NaOH溶液，配成1.5%的溶液。若对羟基联苯颜色较深，应用丙酮或无水乙醇重结晶。放置时间较长后，会出现针状结晶，应摇匀后使用。

0.5%糖原溶液（或淀粉溶液）；20%三氯乙酸溶液；氢氧化钙（粉末）；浓硫酸；饱和硫酸铜溶液；1/15mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）。

二、材料

兔肌肉糜。

三、器材

试管 1.5×15cm（×8）及 试管 架；移液管5mL（×2）, 2 mL（×1）, 1mL（×2）；滴管；量筒10mL（×4）；玻璃棒；恒温 水浴 ；沸 水浴 。

操作方法

一、 制备肌肉糜

将兔杀死后，放血，立即割取背部和腿部肌肉，在低温条件下用剪刀尽量把肌肉剪碎成肌肉糜。注意，应在临用前制备。

二、肌肉糜的糖酵解

取4支 试管 ，编号后各加入新鲜肌肉糜0.5g。1,2号管为样品管，3,4号管为空白管。向3，4号空白管内加入20%三氯乙酸3mL，用玻璃棒将肌肉糜充分打散，搅匀，以沉淀蛋白质和终止酶的反应。

然后分别向4支 试管 内各加入3mL磷酸 缓冲液 和1mL 0.5%糖原溶液（或0.5%淀粉溶液）。用玻璃棒充分搅匀，加少许液体石蜡隔绝空气，并将4支试管同时放入37℃恒温水浴中保温。

1.5h后，取出试管，立即向1，2号管内加入20%三氯乙酸3mL，混匀。将各试管内容物分别过滤，弃去沉淀。量取每个样品的滤液5mL，分别加入到已编号的试管中，然后向每管内加入饱和硫酸铜溶液1mL，混匀，再加入0.5g氢氧化钙粉末，用玻璃棒充分搅匀后，放置30min，并不时搅动内容物，使糖沉淀完全。将每个样品分别过滤，弃去沉淀。

三、乳酸的测定

取4支洁净、干燥的试管，编号，每个试管加入浓硫酸2mL，将试管至于冷水浴中，分别用小滴管取每个样品的滤液1滴或2滴，逐滴加入到已冷却的上述浓硫酸溶液中（注意滴管大小尽可能一致），随加随摇动试管，避免试管内的溶液局部过热。

将试管混合均匀后，放入沸水浴中煮5min，取出后冷却，再加入对羟基联苯试剂2滴，勿将对羟基联苯试剂滴到试管壁上，混匀试管内容物，比较和纪录各试管溶液的颜色深浅，并加以解释。

注意事项

（1）对羟基联苯试剂一定要经过纯化，使其呈白色。

（2）在乳酸测定中，试管必须洁净、干燥，防止污染，影响结果。